FSHW | 山羊酪蛋白水解物通过调节神经递质水平和肠道微生物群组成缓解小鼠失眠

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Introduction

神经性疾病在全球具有很高的患病率。最常见的神经性疾病包括焦虑症、失眠、自闭症和癫痫，其中失眠是最常报道的神经性疾病。根据世界卫生组织最近的一项调查发现，全球睡眠障碍的发病率已达到27%。自2019年全球爆发新型冠状病以来，失眠在全球范围内的发病率有所上升，从而又引发了许多并发症，如抑郁症、阿尔茨海默病、糖尿病、心血管疾病等，对全球公众健康和生活质量构成严重威胁。目前，最常用的治疗失眠的方法是药物治疗，包括褪黑激素和苯二氮卓类药物。然而，长期药物治疗可导致神经毒性过大、耐受性和成瘾性等不良反应。因此，需要一种更安全、更有效的替代方法来改善失眠。

乳制品一直被认为是天然的助眠剂。羊奶是重要的乳制品，含有可能具有生物活性的物质，如乳清蛋白和酪蛋白，这些物质已被证明对人类健康和新陈代谢有重要作用。乳蛋白经酶法水解后，可产生多种具有生物活性的多肽，且已被证明在睡眠、学习和记忆中发挥重要作用。目前研究表明，酪蛋白水解物可改善原发性失眠，并显著影响体内氯离子流和竞争性γ-氨基丁酸(GABA)GABAA受体(GABAAR)活性。尽管这些证据表明乳源活性肽可以缓解失眠，但其潜在机制尚未完全阐明。

江南大学食品学院王洪新教授课题组通过肠-脑轴评估山羊奶酪蛋白水解物（CPH）对PCPA诱导的失眠小鼠的睡眠时间、神经递质水平和肠道微生物群的影响，揭示山羊奶酪蛋白可能成为功能性食品中所提及的替代品或补充剂，用以缓解失眠。

Results and discussion

山羊奶酪蛋白和乳清蛋白水解蛋白的特性研究

DH和分子量分布

图1描述了山羊奶酪蛋白和乳清蛋白采用木瓜蛋白酶水解6 h的DH值。木瓜蛋白酶水解6 h后，酪蛋白和乳清蛋白均被水解为多肽，且酪蛋白的水解程度大于乳清蛋白。此外，从分子量分布来看，CPH和WPH中小于1 kDa的分子量均在80%以上，12.46%~13.77%的分子量均在1~3 kDa之间，CPH中＞5 kDa的分子量均在1%以下（图1A,B）。

图1 山羊乳酪蛋白和乳清蛋白水解度和分子量分布

RP-HPLC

如图1E所示，将完整的山羊奶酪蛋白、乳清蛋白与水解产物进行对比，发现酪蛋白和乳清蛋白的2 个主峰在77~89 min被洗脱，经木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解后，酪蛋白和乳清蛋白被完全降解，洗脱时间缩短。CPH和WPH的洗脱时间在0~59 min。

傅里叶红外色谱法

与酪蛋白相比，CPH中CH2峰的强度降低，表明酪蛋白的疏水区被蛋白水解破坏（图1D）。从表1可以看出，山羊奶酪蛋白和乳清蛋白的二级结构以β-折叠为主，其次是β-转角和随机卷曲。经胰蛋白酶酶解后，β-转角明显增大，而β-折叠角明显减小。结果表明，酶解后酪蛋白和乳清蛋白的结构不断被破坏，更多的亲水性残基形成β-转角结构。

表1 酪蛋白和乳清蛋白水解物二级结构(%)

山羊奶蛋白水解物对小鼠睡眠状态的影响

CPH和WPH干预后，结果如图2所示，与CT组相比，模型组睡眠时间明显缩短，睡眠潜伏期明显延长，说明造模成功。与CT组比较，CPH组在12 h内睡眠时间明显延长，戊巴比妥钠诱导的睡眠潜伏期明显降低，CPH组睡眠质量优于WPH组。结果表明，CPH对小鼠失眠有良好的改善作用。

山羊奶蛋白水解物对小鼠神经递质的影响

睡眠被认为与神经递质密切相关。PCPA阻断5-HT的合成。同样，本研究发现，与CT组相比，模型组的5-HT水平明显降低，GABA也呈现出同样的趋势。经CPH干预后，GABA和5-HT水平明显提高（图2）。

图2 山羊乳酪蛋白和乳清蛋白水解物对小鼠的睡眠和神经递质的影响

山羊奶蛋白水解物对小鼠空肠和下丘脑病理的影响

具体来说，图3显示CT组小鼠空肠上皮细胞排列整齐，绒毛黏膜连续完整。与CT组比较，Model组小鼠空肠绒毛间断数量较多，上皮细胞排列紊乱，有明显炎症反应。CPH和WPH干预后，小鼠上皮细胞排列改善，绒毛高度和肠壁厚度较模型增加。此外，CT组下丘脑神经细胞丰富，形态良好，分布均匀，排列整齐，而Model组下丘脑神经细胞变形严重，排列不紧密，有许多破碎的小细胞和不规则的锥形细胞。值得注意的是，CPH组神经元细胞排列整齐，萎缩细胞数量明显减少，细胞核清晰可见，细胞间基质均匀，神经元排列整齐。

图3 山羊乳酪蛋白和乳清蛋白水解物对小鼠的空肠和下丘脑病理状态的影响

山羊奶酪蛋白和乳清蛋白酶水解物对小鼠粪便微生物群的影响

本研究应用高通量测序技术系统分析羊奶水解物干预后微生物组成的变化。首先，通过主坐标分析（PCoA）图可视化了5 组之间的微生物群组成的差异。CT组、CPH组、WPH组聚簇距离较近，说明三组肠道菌群结构虽然存在差异，但相似性较高，而模型组距离较远。这些结果表明，失眠小鼠的粪便微生物群结构与其他4组具有显著差异。为进一步研究细菌群落具体变化，作者比较了5 组细菌中主要门水平和属水平的相对丰度，特别是对山羊乳酪蛋白和乳清水解物干预表现出显著变化的细菌。Model、DZP、CPH和WPH组小鼠粪便微生物种类变化较大，主要包括Firmicutes, Proteobacteria 和Bacteroidetes。在门水平上，Model组Firmicutes和Verrucomicrobiota的相对丰度显著低于CT组，而Proteobacteria和Campilobacterota的相对丰度则呈现相反趋势。其次，CPH和WPH组的Firmicutes和Verrucomicrobiota的相对丰度增加了，Campilobacterta的相对丰度呈现相反的趋势。有趣的是，CPH和WPH组Lactobacillus、Akkermansia和Faecalibaculum均增加。在

图4 山羊乳酪蛋白和乳清蛋白水解物对小鼠粪便微生物的影响

Conclusion

总之，山羊奶蛋白水解物显著改善了失眠小鼠的睡眠状态，恢复了神经递质系统。同时，山羊奶酪蛋白水解物增加了小鼠有益菌的相对丰度，如Lactobacillus, Akkermansia和Bacteroides，降低了促炎菌的相对丰度，如Helicobacter和Escherichia-Shigella。虽然这些初步研究确实显示了山羊奶蛋白水解物在缓解失眠方面的功效，但建议需要进一步研究，包括鉴定有效肽段具体序列和不同年龄段失眠的有效性，以收集更多的证据来支持这些发现。

第一作者简介

01

莫玲，女，江南大学食品学院2020级博士研究生，桂林医学院公共卫生学院食品卫生与营养学教研室专任教师，研究方向：膳食成分对慢性疾病的干预及作用机制和构效关系。以第一作者发表学术论文9 篇，其中包括Journal of Agricultural and Food Chemistry，Food & Function等。

通信作者简介

02

王洪新，男，食品工程博士，江南大学食品学院教授、博士生导师。现为中国营养学会、粮油学会、农产品深加工学会、中国茶叶学会等会员。长期从事高等教育教学、科研及管理工作。发表了300余篇科技论文，其中60余篇SCI。授权25项发明专利；主编《食品新资源》、副主编《功能性食品设计与评价》、《食品安全危害与控制措施》等5 部专著。参与承担国家级项目8 项，及省部级项目10余项。科技成果获中国商业联合会科技进步特等奖，“国家轻工业联合会科技进步二等奖，江苏省科技进步三等奖等。已招收指导培养80多名硕士生和20多名博士生。先后荣获国家轻工总会先进个人、省教育系统科技先进个人、教育部对口支援西部高校10年突出贡献个人、石河子大学三等功、江南大学优秀教育工作者、优秀党员等称号。先后担任无锡轻工大学大学科学园主任，江南大学科技产业集团、国家大学科学园副总，新疆石河子大学食品学院院长（挂职援疆06-08年）、江南大学科技处副处长、资产管理经营公司总经理、继续教育与网络教育学院院长等。曾赴美国、日本、韩国考察交流。

Goat casein hydrolysates alleviated insomnia in mice via modulating the level of neurotransmitters and the composition of gut microbiota

Ling Moa,b,c, Huijuan Jinga,b, Xiaojing Dua,b, Chaochao Zhaoc, Yintao Linc, Jie Lid, Hongxin Wanga,b,*

a State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

b School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

c School of Public Health, Guilin Medical University, Guilin 541199, China

d Sweet Inn (Guangzhou) Technology Development Co., Ltd., Guangzhou 510075, China

*Corresponding author.

Abstract

Insomnia is associated with neurotransmitters and intestinal dysbiosis. Though studies have demonstrated the ameliorative effects of milk hydrolysates on insomnia, the underlying mechanisms require further exploration. In this study, we investigated how papain hydrolysates of goat casein (CPH) and whey protein (WPH) affected mice’s sleeplessness. Here, we show that CPH effectively improved the total sleep time in 12 h and restoring neurotransmitters (5-hydroxytryptamine (5-HT), γ-aminobutyric acid (GABA), dopamine (DA), and norepinephrine (NE)) in mice. Further gut microbiota analysis revealed a significant increase in the relative abundance of Helicobacter and Escherichia-Shigella and a decrease in the relative abundance of Lactobacillus in the insomnia model mice (Model). Compared to the Model group, both CPH and WPH significantly increased the relative abundance of Akkermansia and Lactobacillus while lowering the relative abundance of Helicobacter and Escherichia-Shigella. Notably, while diazepam (DZP) increased mouse sleep duration, it also increased the relative abundance of Colidextribacter, Parasutterella, Muribaculaceae, and Prevotella. Additionally, the gene expression and protein expression of GABAA receptor, cAMP-response element binding protein (CREB), and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) were upregulated in the hypothalamus. We also discovered a link between intestinal gut microbiota and neurotransmitters. Overall, our results suggest that goat milk hydrolysates, especially CPH, can effectively improve insomnia, providing a theoretical basis for further experimentation and individualized designs.

Reference:

MO L, JING H J, DU X J, et al. Goat casein hydrolysates alleviated insomnia in mice

via

文章翻译由作者提供

编辑：王佳红；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意

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