液质联用技术（LC-MS/MS）在水稻茉莉酸含量检测中的应用与优势

在水稻生理与抗逆机制研究领域，茉莉酸（Jasmonic acid，JA）作为关键的植物激素，其含量变化直接调控水稻的抗虫防御、逆境响应及生长发育进程。然而，水稻体内茉莉酸含量极低，且样品基质中富含叶绿素、多糖、酚类等干扰物质，传统检测技术难以实现精准定量。液质联用技术（LC-MS/MS）凭借 “高效色谱分离 + 高灵敏质谱检测” 的双重优势，成为水稻茉莉酸含量检测的核心技术手段，为解析茉莉酸在水稻抗逆、育种中的功能提供了可靠的数据支撑。

一、水稻茉莉酸检测的技术痛点：为何需要 LC-MS/MS 技术？
水稻作为单子叶模式作物，其茉莉酸检测面临三大核心挑战，传统技术难以突破：
含量痕量化，灵敏度要求高：水稻叶片、根系或籽粒中茉莉酸的基础含量仅为 0.1-5 nmol/g FW，尤其在非胁迫状态下，含量常低于高效液相色谱（HPLC）紫外检测器的检测限（通常≥10 nmol/L），导致传统 HPLC 难以捕捉真实含量；
基质干扰强，特异性不足：水稻组织中含有的黄酮类化合物、脂肪酸衍生物等，其色谱保留行为与茉莉酸相似，若采用单一色谱分离（如 HPLC），易出现 “假阳性” 峰，无法准确区分目标物与干扰物；
动态变化快，需精准追踪：在水稻遭遇稻飞虱侵害、干旱胁迫或机械损伤时，茉莉酸含量会在几分钟至几小时内快速波动（如胁迫后 1h 内含量可提升 2-3 倍），需检测技术具备快速响应与微量变化捕捉能力。
而 LC-MS/MS 技术通过 “色谱分离去除基质干扰 + 质谱特异性识别目标物” 的技术路径，可完美解决上述痛点，成为当前水稻茉莉酸含量检测的首选技术。

二、LC-MS/MS 检测水稻茉莉酸的核心技术流程：从样品前处理到数据定量
LC-MS/MS 检测水稻茉莉酸需严格控制每一步操作，确保结果的准确性与重复性，具体流程可分为 4 个关键环节：
（一）样品前处理：保障茉莉酸完整提取
水稻组织（叶片、根系、籽粒等）的前处理是检测成功的基础，需重点规避茉莉酸降解与基质残留：
样品采集与保存：选取目标生育期的水稻组织（如分蘖期叶片、灌浆期籽粒），快速用液氮冷冻（避免茉莉酸在室温下被酯酶降解），并于 - 80℃冰箱保存；
研磨与提取：称取 0.1-0.5g 冷冻样品，加入聚乙烯研磨管中，添加 5mm 钢珠，在液氮环境下用组织研磨仪（30Hz，2min）研磨成粉末；随后加入含内标（如 D6 - 茉莉酸，浓度 100 ng/mL）的提取溶剂（常用甲醇 - 水 - 甲酸混合液，体积比 80:19:1），涡旋振荡 1min 后，置于 4℃冰箱避光提取 12h；
净化与过滤：提取后的样品经 12000 rpm、4℃离心 15min，取上清液过 0.22μm 有机相滤膜，再通过固相萃取柱（如 C18 柱）去除多糖、色素等杂质 —— 依次用 5mL 甲醇活化柱子、5mL 水平衡柱子，上样后用 5mL 5% 甲醇水溶液淋洗，最后用 5mL 甲醇洗脱目标物，收集洗脱液并真空浓缩至干，用 100μL 初始流动相复溶，待进样检测。
技术要点：内标（D6 - 茉莉酸）需在提取步骤前加入，用于校正提取过程中的茉莉酸损失；固相萃取柱的活化、平衡与洗脱步骤需严格控制流速（1-2 滴 / 秒），避免目标物流失。
（二）色谱分离：优化条件去除基质干扰
采用反相高效液相色谱柱（如 Agilent ZORBAX SB-C18，2.1×150mm，3.5μm）进行分离，核心参数设置如下：
流动相：A 相为 0.1% 甲酸水溶液，B 相为乙腈；
梯度洗脱程序：0-2min，5%B；2-10min，5%-95%B；10-12min，95%B；12-12.1min，95%-5%B；12.1-15min，5%B；
流速：0.3 mL/min；
柱温：30℃；
进样量：5μL。
该条件下，水稻基质中的干扰物（如脂肪酸、黄酮）与茉莉酸可实现有效分离，茉莉酸的保留时间约为 7.2-7.5min，无明显峰重叠。
（三）质谱检测：特异性识别与痕量定量
采用三重四极杆质谱仪（如 AB Sciex Qtrap 6500+），以电喷雾电离源（ESI-）为离子源，通过多反应监测模式（MRM）检测茉莉酸的特征离子，关键参数如下：
离子源参数：喷雾电压 - 4500 V，离子源温度 550℃，雾化气（GS1）50 psi，辅助气（GS2）50 psi，气帘气（CUR）35 psi；
MRM 离子对：茉莉酸（分子量 209.2）的母离子为 m/z 207.1，定量子离子为 m/z 59.0，定性子离子为 m/z 141.0；内标 D6 - 茉莉酸的母离子为 m/z 213.1，定量子离子为 m/z 65.0；
碰撞能量：定量离子对碰撞能量 - 28 eV，定性离子对碰撞能量 - 22 eV。
通过该设置，LC-MS/MS 可特异性识别茉莉酸，即使水稻基质中存在微量干扰物，也能通过特征离子对排除干扰，检测限（LOD）可达 0.01 nmol/g FW，满足水稻茉莉酸痕量检测需求。
（四）数据定量与方法验证
采用外标法结合内标校正进行定量：配制茉莉酸标准品溶液（浓度 0.01、0.05、0.1、0.5、1、5 nmol/mL），绘制标准曲线（R² 需≥0.999）；根据样品中茉莉酸与内标的峰面积比，代入标准曲线计算实际含量。
方法验证需满足以下指标，确保数据可靠：
回收率：85%-115%（添加低、中、高 3 个浓度水平的标准品至水稻样品中）；
相对标准偏差（RSD）：日内 RSD<5%，日间 RSD<8%（同一样品连续检测 6 次，连续检测 3 天）；
基质效应：基质匹配标准曲线与溶剂标准曲线的斜率差异 < 10%，证明基质干扰已有效去除。
三、LC-MS/MS 在水稻茉莉酸检测中的典型应用场景
LC-MS/MS 技术凭借高灵敏度与高特异性，已广泛应用于水稻茉莉酸相关的基础研究与育种实践，核心应用场景包括：
（一）水稻抗虫防御机制研究
茉莉酸是水稻抗虫（如稻飞虱、二化螟）的关键信号分子。通过 LC-MS/MS 检测抗虫品种与感虫品种在虫害胁迫下的茉莉酸含量变化，可解析抗虫机制。例如，研究发现水稻抗稻飞虱品种 “IR36” 在虫害后 2h，叶片茉莉酸含量从 0.3 nmol/g FW 升至 1.8 nmol/g FW，而感虫品种 “TN1” 仅升至 0.8 nmol/g FW；进一步结合转录组分析，证实 LC-MS/MS 检测的茉莉酸含量变化与抗虫基因（如 OsJAZ1、OsMYC2）的表达量呈显著正相关（r=0.87，P<0.01），为抗虫机制解析提供了直接证据。
（二）水稻非生物胁迫响应研究
在干旱、盐渍、低温等非生物胁迫下，LC-MS/MS 可精准捕捉水稻茉莉酸的动态变化，揭示胁迫响应规律。例如，在水稻干旱胁迫实验中，用 LC-MS/MS 追踪根系茉莉酸含量发现：胁迫 0-6h，茉莉酸含量缓慢上升（从 0.2 nmol/g FW 升至 0.5 nmol/g FW）；6-12h 快速升至 1.2 nmol/g FW；复水后 2h 回落至 0.4 nmol/g FW—— 该动态变化与根系抗氧化酶（SOD、POD）活性的变化趋势一致，证明茉莉酸参与水稻干旱胁迫的早期响应。
（三）水稻育种中的茉莉酸含量筛选
在抗逆、优质水稻育种中，茉莉酸含量可作为筛选指标。通过 LC-MS/MS 高通量检测不同水稻种质资源的茉莉酸基础含量与胁迫诱导含量，可快速筛选优异基因型。例如，某科研团队用 LC-MS/MS 检测 120 份水稻种质的叶片茉莉酸含量，发现茉莉酸基础含量≥0.5 nmol/g FW 的种质，在盐胁迫下的相对存活率比低含量种质高 30%-40%；最终筛选出 3 份高茉莉酸含量的抗盐种质，为抗盐水稻育种提供了亲本材料，育种效率提升 50%。

四、LC-MS/MS 相比传统技术的核心优势：为何成为水稻茉莉酸检测首选？
与高效液相色谱（HPLC）、酶联免疫法（ELISA）等传统技术相比，LC-MS/MS 在水稻茉莉酸检测中具备不可替代的优势，具体对比如下：
检测技术 检测限（LOD） 特异性 基质干扰抗性 适用场景 水稻样品检测优势
LC-MS/MS 0.01 nmol/g FW 高（特征离子对识别） 强（色谱 + 质谱双重净化） 痕量检测、动态变化追踪、多样品高通量分析 可精准检测水稻低含量茉莉酸，有效去除叶绿素、多糖干扰，适合胁迫下快速变化检测
HPLC（紫外检测） ≥10 nmol/L 低（仅靠保留时间识别） 弱（易受共流出物干扰） 高含量茉莉酸样品检测 无法检测水稻基础茉莉酸含量，基质干扰导致数据偏差大
ELISA 0.1 nmol/g FW 中（抗原抗体特异性结合） 中（易受交叉反应影响） 快速定性筛查 无法区分茉莉酸与结构类似物（如茉莉酸甲酯），定量准确性低
从对比可见，LC-MS/MS 在检测灵敏度、特异性与抗干扰能力上均远超传统技术，完全匹配水稻茉莉酸痕量、复杂基质的检测需求。

若科研人员需针对特定水稻组织（如花粉、幼穗）或特定研究场景（如茉莉酸甲酯与茉莉酸的同步检测）优化 LC-MS/MS 方案，可结合样品特性调整前处理方法与质谱参数，进一步提升检测效果。

菲优特检测可提供茉莉酸含量检测服务
检测费用：根据客户检测需求以及实验复杂程度进行报价
检测周期：7-15个工作日（可加急）
检测流程：1)电话咨询 2)报价 3)邮寄样品或上门取样 4)支付检测费用，开展实验 5)完成实验，出具检测报告 6)邮寄检测报告，售后服务
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