Cell | Microcolony-seq 揭示病原菌群体中的遗传性表型异质性

撰文|Sure

在多细胞生物中，细胞分化是很常见的，即使在遗传背景相同的细胞之间，也可能表现出不同的、稳定的表型（如不同类型的细胞）。这种现象不仅存在于多细胞组织中，也出现在单细胞真核生物中，例如酵母和疟原虫【1,2】。从 Novick和Weiner 的开创性研究开始，科学家们已经认识到即使在克隆细菌群体中，也存在单细胞水平的表型异质性【3】。这种异质性揭示了对基因调控机制的理解，并且在临床和进化上具有重要意义。然而，有些转录水平的差异可能只是短暂的“噪声”，对表型并无实质影响。这种被称为偶发性波动（非遗传性），例如某个基因在某一时刻没被转录，但并不一定有表型后果。而稳定的遗传性异质性会导致表型差异，并且可以跨多个世代稳定遗传。遗传学异质性可导致细菌群体形成具有不同功能的子群体，具有免疫逃逸、群体内部分工、风险对冲或定殖能力的差异。在研究细菌群体的异质性时，scRNA-seq虽然可以捕捉到异质性，但存在局限性：破坏性提取RNA导致细菌无法进行下游分析；难以判断差异是来自突变还是表型异质性；也无法评估转录差异对表型或适应度的真实影响。

2025年8月26 日， 来自 以色 列 耶路撒冷希伯来大学 的 Nathalie Q. Balaban 和Ilan Rosenshine 在 Cell 上 发表了论文 Uncovering phenotypic inheritance from single cells with Microcolony-seq 。 在本研究中， 作者开发了 Microcolony-seq ，这一技术 提供了一种高分辨率的手段来揭示病原体感染过程中的遗传与表型异质性，对抗感染治疗策略设计具有直接启示 。

肠致病性大肠杆菌（ enteropathogenic Escherichia coli ,EPEC）就是一个很好的研究异质性的模型【4,5】。在体外模拟宿主条件培养时，EPEC会形成两种大小不同但遗传相同的菌落，显示出生长速度不同的表型。 这种“记忆”在指数生长期稳定存在，但在达到静止期后会被“重置”。 区分不同菌落的传统方法是依赖肉眼的菌落形态来识别，难以把基因型差异与表型差异区分开。为了解决这个问题，作者把单个细胞的状态放大成微型菌落（ microcolony ），对每个微菌落进行转录组（RNA-seq）+全基因组测序（WGS）+后续表型验证。作者将这个策略称为M icrocolony -seq，这样既能捕捉单细胞的遗传性表型状态，又能追溯这些差异究竟是基因突变还是表型调控记忆导致。利用M icrocolony -seq，可以不用看形态也能区分稳定遗传的表型状态， microcolony 被分为两个亚群。一类亚群显著上调已知EPEC毒力基因，另一亚群则下调毒力基因并上调运动/趋化基因。作者将前者命名为VirEPEC（多为小菌落），后者为AvirEPEC（多为大菌落）。这些发现也解释了启动毒力程序代价高导致细菌生长慢，菌落小的结果。在VirEPEC中上调的基因中，作者发现了一个新的毒力基因pilW，它能帮助细菌粘附在宿主细胞上。重要的是，这一方法揭示的差异是在同一平板、同一遗传背景下获得的，排除了外界环境或突变的干扰，为毒力表型的固有双稳态提供了直接证据。

作者进一步在三种环境下重复试验，包括：丁酸（短链脂肪酸，已知与毒力调控有关）；婴儿粪便代谢物（EPEC的主要感染宿主为婴儿）；厌氧条件（模拟小肠环境）。结果发现，三种环境均可稳定分离出VirEPEC和AvirEPEC，且差异方向一致。 基于 RNA-seq 的提示，作者利用冷冻保存的微菌落进一步验证 AvirEPEC 的功能特征。 结果表明， AvirEPEC 在软琼脂迁移实验中表现出更高的运动性 ，且 上调 group 4 capsule (G4C) 基因，与在高盐环境下的生长优势一致 。 使用 per 启动子驱动的 GFP 报告系统发现，在高盐环境中，AvirEPEC（GFP-OFF）形成具有胞外基质的类生物膜，而 VirEPEC（GFP-ON）则要么转变为 AvirEPEC，要么死亡 。 这说明 AvirEPEC 在非宿主或胁迫条件下更具适应性。

随后，作者 探讨了 VirEPEC 状态在静止期丢失的分子基础。通过 PerB 标记株检测，发现静止期时perABC操纵子表达显著下降。在静止期外源过表达perABC后，VirEPEC记忆不再被抹除。由此可见，perABC正反馈下调是VirEPEC状态记忆消失的关键机制，类似于大肠杆菌中lac/ara操纵子的双稳态机制。 对厌氧条件下 VirEPEC 微群落分析发现其内部也存在分化，其中一类是与fim操纵子（I型菌毛）有关。 F im的表达存在两个群体，高表达（ON）和低表达（OFF），这一差异源于fim启动子的相位异变，且在微菌落水平至少可稳定维持20代。在另一分化方向上， VirEPEC 微菌落出现异常的鞭毛和趋化基因上调，运动性显著增强（比AvirEPEC高5倍，比普通 VirEPEC高9倍）。该表型在静止期仍保持稳定。WGS鉴定到这些微菌落的lrhA基因发生突变，该基因通常抑制鞭毛表达。突变位点位于微卫星重复序列，提示为突变热点。这些结果表明，超鞭毛亚群源自遗传突变而非表型记忆。结合既往临床报道，lrhA突变与高毒力EPEC感染相关。

文章的最后，作者将M icrocolony -seq应用于临床样本分析。在一例尿路感染（UTI）患者的尿液样本中，24个形态一致的UPEC微群落被分析。研究发现， 部分微菌落带有抗生素耐药基因簇（链霉素、磺胺、四环素），部分不带。药敏实验验证了对应的耐药差异。这提示单菌落药敏试验可能低估真实耐药性。独立于基因差异，还检测到 VirUTI与AvirUTI两群，前者上调铁获取 、 T2SS、毒素与酸应答基因，后者下调这些通路。患者尿液pH=5.0，与VirUTI的酸应答一致，说明其保留了宿主环境的记忆。在限铁环境中，VirUTI与AvirUTI表现出明显差异：AvirUTI显示超敏感性，无法在限铁条件下生长。原始尿液中的检测结果同样显示大部分 细 菌无法在限铁平板上形成菌落。该表型在微菌落水平可继承，但在过夜培养进入静止期后被抹除。这表明铁代谢表型是短期可遗传的宿主记忆，其稳定性有限。 此外，在一例金黄色葡萄球菌血流感染（BSI）样本中， 尽管血液中菌量极低（<50 CFU/mL），Microcolony-seq仍成功分离出 23个微菌落。 这些 微菌落具有克隆性，但分为VirBSI、IntermediateBSI和AvirBSI三 类亚 群。VirBSI显著上调15个荚膜基因和多种毒力因子；IntermediateBSI特异性表达spA；酸应答基因在三群间存在差异。功能上，酸敏感记忆在微菌落水平可见，但在静止期被抹除。结合患者存在心瓣生物膜的背景，提示酸应答可能来源于生物膜环境。这一结果表明，不同亚群表达不同抗原，若疫苗或抗体仅针对单一毒力因子，可能无法覆盖所有亚群，从而影响治疗效果。

总的来说， 通过在实验室株与临床样本中的应用，作者系统证明了Microcolony-seq能稳定识别表型遗传与基因突变导致的亚群；VirEPEC/AvirEPEC双稳态受 perABC正反馈维持，在静止期下调时被重置；在临床样本中，多亚群共存且具有不同的毒力与耐药特征 。 这种异质性具有重要临床意义：单一菌落药敏可能低估耐药风险，单靶疫苗可能难以覆盖所有亚群。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.08.001

制版人： 十一

参考文献

1. Kumar, A. (2021). The Complex Genetic Basis and Multilayered Regulatory Control of Yeast Pseudohyphal Growth.Annu. Rev. Genet.55, 1–21.

2. Recker, M., Buckee, C.O., Serazin, A., Kyes, S., Pinches, R., Christodoulou, Z., Springer, A.L., Gupta, S., and Newbold, C.I. (2011). Antigenic variation in Plasmodium falciparum malaria involves a highly structured switching pattern.PLoS Pathog. 7, e1001306.

3. Novick, A., and Weiner, M. (1957). Enzyme Induction as an All-or-None Phenomenon.Proc. Natl. Acad. Sci. USA43, 553–566.

4. Leh, H., Khodr, A., Bouger, M.C., Sclavi, B., Rimsky, S., and Bury-Mone ́ , S. (2017). Bacterial-Chromatin Structural Proteins Regulate the Bimodal Expression of the Locus of Enterocyte Effacement (LEE) Pathogenicity Island in Enteropathogenic Escherichia coli.mBio8, e00773–e00717.

5. Ronin, I., Katsowich, N., Rosenshine, I., and Balaban, N.Q. (2017). A long-term epigenetic memory switch controls bacterial virulence bimodality.eLife6, e19599.

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