Nature | 在细胞表面实现可编程的蛋白连接

撰文|亦

细胞表面特征因细胞类型而异，且在疾病环境中常发生改变【1-3】。 由此产生 多种治疗策略， 并基于此 开发诊断工具。 当 下 前沿策略往往依赖 单一表面抗原，但 单抗原 几乎无法精确定义特定细胞类型【4-5】。因此，亟需开发可编程分子系统——通过整合多重细胞表面特征，将靶向输入转化为用户自定义输出。

近日，来自普林斯顿大学化学系的Tom W. Muir团队在Nature上发表了题为Programmable protein ligation on cell surfaces的文章 。 开发了名为SMART（Splicing-Modulated Actuation upon Recognition of Targets）的蛋白质执行器平台，其核心是利用条件性蛋白质反式剪接 (Conditional Protein trans-Splicing，CPS) 技术。关键突破在于采用了笼蔽式分裂内含肽 (caged split intein) 设计。该蛋白执行器平台可在特定细胞表面实现汇聚式蛋白连接，且具有系统兼容性与应用潜力 。

首先，作者构建了基于条件性蛋白剪接的蛋白执行器SMART系统。他们使用 NrdJ-1分裂内含肽，引入 C76V突变消除非催化半胱氨酸潜在的氧化敏感性问题。通过FKBP/rapamycin/FRB三杂交系统模拟细胞共定位，作者成功筛选并优化了笼蔽结构，显著抑制了自发激活。优化后的笼蔽设计在诱导下能实现高效剪接。再使用X射线晶体学解析融合NrdJ-1结构，为后续理性设计提供了关键依据。并将优化的笼蔽分裂内含肽片段分别融合到靶向不同细胞表面抗原（如HER2, EGFR）的载体和功能蛋白片段（如SpyCatcher003的SpyN/SpyC）上，构建成SMART-SpyCatcher系统。随后，作者进行了AND逻辑门控验证。他们用K562细胞模型处理SMART-SpyCatcher，结合流式细胞术/共聚焦显微镜检测SpyTag003-AF594荧光信号，机制研究表明，阻断靶向结合、剪接或SpyTag结合中任一环节均导致信号完全丧失。

接下来作者开始调控响应动态与复杂逻辑门。首先基于NrdJ-1晶体结构，对 eNrdJ-1Ncage 进行理性改造。分别突变静电界面残基，调整笼蔽长度。而后引入 “诱饵(decoy)”蛋白，该蛋白能与SpyC剪接形成有缺陷的SpyCatcher003，从而在特定细胞上抑制功能输出，实现了 NOT逻辑门。作者成功演示复杂逻辑运算，如 [HER2 AND EpCAM NOT EGFR]，在混合细胞群中实现精准靶向。在随后的逻辑门控靶向细胞清除中，作者分别在K562HER2+/EGFR+细胞、混合K562细胞群和A431细胞上进行门控，发现对照组（错误逻辑门或无毒素）无显著清除效果，证明了逻辑门控细胞清除策略的有效性和特异性。

于是作者开始拓展靶向载体的多样性并成功将多种靶向载体融合到SMART系统。经过多种细胞模型的验证，这些新型载体均能实现预期的逻辑门控输出（如[HER2 AND CEACAM6]，[HER2 AND CXCR4]，[EGFR AND ADORA2A]），证明了平台的高度模块化和载体普适性。进一步地，作者将SMART系统与邻近标记技术结合，用于研究特定细胞表面微环境。如AND门控APEX2邻近标记和AND门控μMap光催化邻近标记，两种技术均实现空间分辨的蛋白质组映射，μMap凭借其超高时间分辨率和更小的标记半径，尤其适用于动态或紧密的微环境研究。最后，作者开发可释放型细胞因子SMART-IL-1β。选择具有复杂β-桶结构的 白细胞介素-1β (IL-1β) 作为功能输出蛋白，在OE19细胞上激活 [HER2 AND EpCAM] 门控，证实释放的IL-1β具有强生物活性。在 K562HER2+/EGFR+ 细胞上使用 [HER2 AND EGFR] 门控也验证了IL-1β的释放和活性，而剂量反应及笼式优化可调节SMART-IL-1β的响应强度。

总的来说， 文章首次实现细胞表面 可 编程的蛋白连接，提出笼式分裂内含 肽 驱动的布尔逻辑门控（AND/NOT/OR），突破单抗原限制，实现多重技术突破，开启了细胞表面编程研究的新范式，同时也为推动精准医学和合成生物学的发展提供了基础 。

https://doi.org/10.1038/s41586-025-09287-2

制版人： 十一

参考文献

1. Bausch-Fluck, D. et al. The in silico human surfaceome.Proc. Natl Acad. Sci. USA115, E10988–E10997 (2018).

2. Dannenfelser, R. et al. Discriminatory power of combinatorial antigen recognition in cancer T cell therapies.Cell Syst.11, 215–228 (2020).

3. Hu, Z. et al. The Cancer Surfaceome Atlas integrates genomic, functional and drug response data to identify actionable targets.Nat. Cancer2, 1406–1422 (2021).

4. Kichloo, A. et al. Systemic adverse effects and toxicities associated with immunotherapy: a review.World J. Clin. Oncol.12, 150–163 (2021).

5. Tarantino, P., Ricciuti, B., Pradhan, S. M. & Tolaney, S. M. Optimizing the safety of antibody–drug conjugates for patients with solid tumours.Nat. Rev. Clin. Oncol.20, 558–576 (2023).

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