MRC-5 与 Vero 细胞：EV-D68 疫苗生产的 “黄金搭档”

摘要:肠道病毒 D68（EV-D68）是一种可引发严重呼吸道疾病和神经系统并发症（如急性弛缓性脊髓炎）的病原体，目前尚无获批疫苗。本文总结了一项突破性研究，该研究通过连续传代技术，成功将 EV-D68 菌株适应于疫苗生产中常用的 MRC-5 和 Vero 细胞，并评估了基于这些适应菌株制备的灭活全病毒疫苗的免疫效果。研究发现，MRC-5 细胞适应菌株可直接通过连续传代获得，而 Vero 细胞适应菌株需先经 MRC-5 细胞适应后再传代培养。动物实验显示，部分适应菌株疫苗能诱导与原始菌株相当的保护性免疫，但部分菌株免疫原性显著下降。这些发现为 EV-D68 疫苗的规模化生产提供了关键数据，同时提示菌株适应过程中需关注免疫原性的稳定性。

一、EV-D68 的威胁：从呼吸道感染到神经系统损伤1.1 病毒特性与致病机制

EV-D68 属于小 RNA 病毒科肠道病毒属，是一种无包膜的二十面体病毒，基因组为单链正链 RNA，长度约 7.4kb。其基因组编码 4 种结构蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）和 7 种非结构蛋白，其中结构蛋白是病毒入侵细胞的关键，非结构蛋白则参与病毒复制和宿主细胞调控。

EV-D68 主要通过呼吸道飞沫传播，感染后多数表现为轻症呼吸道症状（如咳嗽、发热），但儿童、老年人及免疫功能低下者可能发展为重症肺炎。更令人担忧的是，近年来研究发现 EV-D68 与急性弛缓性脊髓炎（AFM）密切相关，患者会出现肢体无力甚至瘫痪，且目前尚无特效治疗药物。

1.2 流行趋势与防控困境

2014-2018 年间，EV-D68 每两年暴发一次，且每次暴发均伴随 AFM 病例激增。2021-2022 年，多个国家再次报告 EV-D68 相关重症呼吸道感染病例，显示其持续流行的威胁。然而，目前全球尚无针对 EV-D68 的预防性疫苗或特异性治疗药物，防控主要依赖对症支持治疗，因此疫苗研发迫在眉睫。

二、疫苗生产的细胞选择：为什么是 MRC-5 和 Vero 细胞？2.1 传统培养细胞的局限

此前 EV-D68 研究多使用RD 细胞（人横纹肌肉瘤细胞），但该细胞存在两大问题：一是未被批准用于疫苗生产，二是具有致瘤性（在裸鼠中可诱发肿瘤）。根据世界卫生组织（WHO）、美国食品药品监督管理局（FDA）等机构的指南，疫苗生产用细胞需通过致瘤性测试，RD 细胞显然不符合要求，因此亟需替代细胞株。

2.2 MRC-5 细胞：安全但有局限

MRC-5 细胞是源自人肺组织的二倍体细胞，已被证实无致瘤性，且安全性经过充分验证，广泛用于麻疹、风疹等疫苗的生产。研究发现部分 EV-D68 菌株可在 MRC-5 细胞中复制，但其缺点是传代 20 次后生长能力显著下降，难以满足大规模疫苗生产需求，更适合小剂量活疫苗制备。

2.3 Vero 细胞：高效但需适应

Vero 细胞是源自非洲绿猴肾的连续细胞系，因无法产生 I 型干扰素而对多种病毒高度易感，已用于脊髓灰质炎、新冠病毒等疫苗生产。但 EV-D68 对 Vero 细胞天然不敏感（非允许性），需通过技术手段使其适应才能用于疫苗生产。

三、EV-D68 菌株的细胞适应：从实验室到生产的关键一步3.1 适应策略与实验设计

研究团队选取了 2014 年美国暴发期间分离的 3 株 EV-D68（MO 株、KY 株、IL 株，分属 B1、D、B2 进化分支），采用连续传代法进行细胞适应：

MRC-5 细胞适应：直接将原始菌株在 MRC-5 细胞中传代 5 次，获得 MRC-5 适应菌株（MRC-P5）。

Vero 细胞适应：先将 MRC-5 适应菌株在 Vero 细胞中传代 15 次，获得 Vero 适应菌株（Vero-P15）（直接将原始菌株在 Vero 细胞中传代未成功）。

3.2 适应效果：病毒滴度的显著提升

通过TCID₅₀（50% 组织培养感染剂量）检测，3 株菌株在适应后病毒滴度明显提高。以 Vero 细胞适应为例，MO 株从初始的 10⁷・⁵ TCID₅₀/mL 升至 10⁸・³ TCID₅₀/mL，KY 株和 IL 株也达到类似水平（表 1），表明适应后的菌株可在目标细胞中高效复制。

表 1：EV-D68 菌株在连续传代中的病毒滴度（TCID₅₀/mL）

3.3 基因突变：适应的分子基础

基因测序显示，适应菌株在结构蛋白（如 VP1、VP3）和非结构蛋白（如 2C、3D）中积累了多个突变。例如：

MO 株 MRC-P5 出现 VP3-E59D、VP1-D87N 等突变；

Vero-P15 额外出现 VP2-H135Y、2C-N258S 突变。

这些突变可能增强了病毒对宿主细胞的吸附或复制能力，但不同菌株的突变位点无统一规律，提示适应机制存在菌株特异性。

四、灭活疫苗的制备与特性分析4.1 疫苗制备流程

研究团队采用β- 丙内酯（BPL）灭活适应菌株，经蔗糖密度梯度离心纯化后，制备灭活全病毒疫苗（WV 疫苗）。关键步骤包括：

病毒培养：在 MRC-5 或 Vero 细胞中培养适应菌株，待出现完全细胞病变效应（CPE）后收集病毒；

灭活与纯化：用 0.05% BPL 灭活病毒，经蔗糖垫层离心和密度梯度离心纯化，获得完整病毒颗粒；

鉴定：通过 SDS-PAGE、Western blot 验证病毒蛋白（如 VP1、VP2），并用电镜观察颗粒形态。

4.2 疫苗的物理化学特性

蛋白组成：SDS-PAGE 显示疫苗中含有 VP1、VP2、VP3 等结构蛋白，但适应菌株的 VP1 分子量略小于原始株，可能与氨基酸突变或蛋白切割差异有关（图 4a）。

颗粒形态：动态光散射（DLS）显示颗粒直径约 30nm，负染电镜观察到典型的二十面体结构，与 EV-D68 形态一致（图 4b、4c）。

五、疫苗的免疫效果评估：保护力与免疫原性的差异5.1 实验设计

研究团队以 BALB/c 小鼠为模型，通过皮下注射接种疫苗（0.1μg / 次，两次免疫间隔 21 天），检测：

特异性抗体：通过 ELISA 检测 EV-D68 特异性 IgG 水平；

中和抗体：通过 TCID₅₀法检测血清中和病毒的能力；

保护效果：免疫后用 EV-D68 鼻腔攻毒，12 小时后检测肺和鼻甲骨中的病毒载量。

5.2 不同菌株疫苗的表现

MO 株适应疫苗：MRC-5 和 Vero 适应菌株疫苗诱导的 IgG 水平、中和抗体效价与原始株疫苗相当，攻毒后肺和鼻甲骨病毒载量显著降低，保护效果无差异（图 5）。

KY 株适应疫苗：Vero 适应菌株疫苗的 IgG 和中和抗体水平与原始株相当，但攻毒后病毒载量略高于原始株疫苗组，保护效果略有下降（图 6a-c）。

IL 株适应疫苗：Vero 适应菌株疫苗虽能诱导 IgG，但几乎无法产生中和抗体，攻毒后病毒载量与未免疫组（PBS 组）无差异，完全丧失保护效果（图 6d-f）。

5.3 免疫原性差异的原因

研究发现，IL 株 Vero 适应菌株的VP1 蛋白出现多个突变（如 T80N、S82T），这些突变位于病毒的中和抗原位点 I附近，可能改变了抗原构象，导致中和抗体无法识别。这提示菌株适应过程中需重点关注结构蛋白突变对免疫原性的影响。

六、研究意义与未来展望6.1 对疫苗研发的启示

本研究首次建立了 EV-D68 对 MRC-5 和 Vero 细胞的高效适应方法，证明这两种细胞可用于疫苗生产，解决了 RD 细胞的安全性问题。同时，研究揭示了菌株适应可能导致免疫原性变化，为筛选稳定有效的疫苗菌株提供了依据。

6.2 待解决的问题

免疫原性稳定性：需进一步研究如何通过精准突变筛选，在保证细胞适应性的同时避免免疫原性下降；

菌株代表性：本研究仅使用 3 株 2014 年分离株，需验证方法对近年流行株（如 B3 分支）的适用性；

安全性评估：需开展疫苗的长期毒性、过敏反应等安全性研究，为临床转化奠定基础。

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