从毫克到克级：瞬时基因表达如何让重组蛋白 “快速量产”？

摘要：在生物制药产业快速发展的今天，重组治疗性蛋白（如抗体）的高效生产成为关键。哺乳动物细胞因能模拟人类细胞的翻译后修饰（如糖基化），成为生产这类蛋白的核心 “细胞工厂”，其中中国仓鼠卵巢（CHO）细胞和人胚肾 293（HEK293）细胞应用最广。与需要长期筛选的稳定基因表达（SGE）系统不同，瞬时基因表达（TGE）系统凭借 “短周期、易操作” 的优势，成为生物药早期研发的重要工具。本文系统梳理了 TGE 系统的组成，详解了细胞系改造、表达载体工程、培养基优化、转染条件筛选、辅助基因共表达等关键优化策略，结合最新研究数据说明如何提升重组蛋白的产量与质量，为产业界提供从实验室到规模化生产的实用参考。

一、引言：生物制药的 “细胞工厂” 与瞬时表达的独特价值

全球生物制药市场规模正以惊人速度扩张，预计 2024 年将达到 3.89 亿美元，其中重组治疗性蛋白是核心组成部分。这类蛋白的生产依赖于合适的表达系统，细菌、酵母、植物虽各有应用，但哺乳动物细胞因能进行复杂的翻译后修饰（PTMs）—— 尤其是与人类细胞相似的糖基化，成为生产抗体等复杂蛋白的首选。

在众多哺乳动物细胞中，CHO 细胞堪称 “王牌选手”：全球 89% 的哺乳动物细胞来源生物药由它生产。这得益于它能合成复杂结构蛋白、可大规模培养且不易受病毒感染的特性。HEK293 细胞则以 “生长快、转染效率高” 著称，在悬浮无血清培养中表现优异，常被用于药物发现和毒性测试。

哺乳动物细胞的表达系统分为两类：稳定基因表达（SGE）和瞬时基因表达（TGE）。SGE 需要筛选稳定整合目的基因的细胞株，周期长达数月；而 TGE 无需复杂筛选，直接将目的基因（GOI）导入细胞，2-4 周就能实现从基因克隆到蛋白表达（产量从毫克到克级），尤其适合早期研发和快速验证（图 1）。不过，TGE 的产量目前仍低于 SGE，如何突破这一瓶颈，正是本文要探讨的核心。

二、瞬时基因表达（TGE）系统的核心组成

TGE 系统的高效运行，依赖于 “细胞系、表达载体、培养基” 三大核心要素的协同作用。

（一）细胞系：生产蛋白的 “种子”

目前 TGE 系统中最常用的是 CHO 和 HEK293 细胞，它们各自衍生出多个亚型，适配不同的生产需求：

CHO 细胞：源自中国仓鼠卵巢组织，已开发出 CHO-S、CHO DG44、GS 敲除 CHO 等亚型。其中 CHO-S 生长快速，适合悬浮培养；GS 敲除型通过谷氨酰胺合成酶筛选，能稳定表达目的蛋白。

HEK293 细胞：源自人胚肾细胞，亚型包括 293E、293T、293F 等。293F 在无血清悬浮培养中可达到高细胞密度，转染效率高，是 TGE 的 “常客”。

不过，HEK293 细胞也有局限：生产的蛋白糖基化结构与人类细胞存在差异，且易受人类病毒污染，限制了其临床应用。

（二）表达载体：携带目的基因的 “运输车”

表达载体是携带目的基因进入细胞的 “工具”，其核心是调控元件，包括启动子、增强子、终止子等，直接影响蛋白表达效率。例如：

启动子：像 “开关” 一样启动基因转录，人类巨细胞病毒（hCMV）启动子是常用的 “强开关”，能高效驱动抗体等蛋白的表达。

辅助蛋白元件：若载体携带 EB 病毒核抗原 1（EBNA-1）或大 T 抗原基因，可帮助目的基因在细胞内稳定存在，提升 TGE 效率。

（三）培养基：细胞生长的 “营养餐”

培养基为细胞提供营养，其成分直接影响细胞活力和蛋白产量。早期培养基需添加 10%-20% 血清，但血清成分复杂、易污染，给下游纯化带来麻烦。如今，无血清培养基（SFM）成为主流：它用明确成分的血清替代物组成，不仅消除了血清干扰，还降低了生产成本，是规模化生产的 “标配”。

三、TGE 系统的优化策略：从细节突破产量瓶颈

要提升 TGE 的效率，需从细胞、载体、培养条件等多维度优化。以下是经过实验验证的关键策略（图 2）。

（一）细胞系改造：让 “细胞工厂” 更高效

通过基因编辑或工程化改造细胞，可增强其抗凋亡能力、提升蛋白合成效率。

敲除凋亡基因：细胞在培养中会因压力凋亡，影响蛋白产量。研究发现，敲除 CHO-K1 细胞的凋亡基因 Bax 和 Bak 后，抗体滴度提升了 3-4 倍；过表达抗凋亡基因 Bcl-xL，CHO-DG44 细胞的融合蛋白产量增加 70%-270%，且细胞活力能维持在 90% 以上。

增强蛋白折叠能力：蛋白在细胞内折叠错误会导致产量下降。若让 CHO 细胞过表达未折叠蛋白反应因子（如 XBP-1S）或内质网氧化还原酶（ERO1-La），可帮助蛋白正确折叠，抗体产量能提升 5.3-6.2 倍。

亚型筛选：ExpiCHO-S™和 Expi293F 等工程化亚型表现突出。Expi293F 在悬浮培养中能达到高细胞密度，转染后蛋白表达量比普通 293 细胞高 3-4 倍，尤其适合需要复杂修饰的蛋白生产。

（二）表达载体工程：让 “运输车” 更能装

优化载体的调控元件，可显著提升目的基因的转录和翻译效率。

启动子优化：双启动子载体（如同时携带两个 hCMV 启动子）比传统单启动子或双顺反子载体更高效，在 CHO 细胞中抗体产量提升 1.4-1.9 倍。此外，cumate 基因开关启动子（CR5）的效率是 hCMV 启动子的 3-4 倍，堪称 “超强开关”。

顺式作用元件：这些元件像 “助推器” 一样增强基因表达。例如，泛染色质开放元件（UCOE）能防止基因被沉默，使抗体产量提升 1.5 倍；将 WPRE（ woodchuck 肝炎病毒转录后调控元件）与内含子 A 等元件组合，可使蛋白表达量提升 10.5 倍。

信号肽优化：信号肽负责引导蛋白分泌到细胞外，选对信号肽能提升分泌效率。人类白蛋白和天青杀素来源的信号肽表现最佳，在 CHO 细胞中可使蛋白产量提升 1.5-2 倍；甚至可通过计算机设计 “定制信号肽”，例如针对难表达的单抗，定制信号肽能使产量提升 2.5 倍。

（三）培养基与培养工艺：为细胞 “量身定制” 生长环境

培养基成分和培养条件的细微调整，能大幅提升细胞活力和蛋白产量。

培养基添加物：

• 蛋白胨（含肽和氨基酸）是 “营养强化剂”，在 CHO-DG44 细胞中添加后，TGE 产量提升 37%；小麦蛋白胨可使细胞生长增加 30%，干扰素 -γ 产量提升 60%。

• 二甲基亚砜（DMSO）和醋酸锂（LiAc）能帮助蛋白折叠，减少聚集。在 CHO 细胞中添加后，抗体产量可达 80mg/L；HEK293 细胞在转染后 4 小时添加 10% DMSO，蛋白表达量提升 1.6 倍，且无明显毒性。

培养工艺优化：

• 温和低温培养：细胞在 37℃快速生长后，转至 32-33℃培养，可使蛋白产量提升 1.5-6.2 倍。这是因为低温能让细胞停留在 G1/G0 期，减少分裂能耗，专注于蛋白合成，同时还能增强内质网的蛋白折叠能力。

• 光照调控：通过 CRISPR-dCas9 光控系统（LACE），可在光照下激活基因表达，使 eGFP（绿色荧光蛋白）的 TGE 产量提升 4 倍，实现 “按需生产”。

转染是将目的基因导入细胞的关键步骤，优化试剂、比例和操作能提升效率。

转染试剂选择：聚乙烯亚胺（PEI）是常用试剂，25kDa 线性 PEI 能使 CHO 细胞的抗体产量提升 2 倍；超支化聚赖氨酸（HBPL）无需预孵育，在含血清培养基中也能高效转染，产量媲美甚至超过 PEI。

试剂比例：PEI 与 DNA 的比例（w/w）为 3:1 时，转染效率最高（60%-66.93%）；在 Bax/Bak 双敲除 CHO 细胞中，当比例为 5:1 时，抗体产量提升 3-4 倍。

辅助方法：电穿孔结合抑制剂处理（如丁酸钠），可使 CHO 细胞的荧光强度提升 4.8 倍；质粒 DNA 经 72℃加热 30 分钟，能提升 HEK293T 细胞的转染效率，可能与去除杂质有关。

（五）辅助基因共表达：为蛋白生产 “搭把手”

共表达某些辅助基因，可增强细胞活力、促进目的基因表达或蛋白折叠。

抗凋亡与增殖基因：共表达 Bcl-xL 能减少细胞凋亡，使 CHO 细胞的蛋白产量提升约 2 倍；EBNA-1 与多瘤病毒大 T 抗原（PyLT）共表达，可使 CHO 细胞的特异性生产力（qP）提升 22.9 倍，因为它们能帮助目的基因在细胞内稳定存在。

microRNA（miRNA）调控：miR-17 和 miR-92a 能促进 CHO 细胞生长，使蛋白产量提升 3 倍；抑制 miR-7 则能减少细胞凋亡，让分泌型碱性磷酸酶（SEAP）的产量翻倍。

蛋白折叠辅助因子：共表达亲环蛋白 B（CypB）与 SP35Fc 融合蛋白（比例 5:1），可消除蛋白聚集，使产量提升 6 倍，且产物更纯净。

四、优化效果汇总：数据见证突破

不同优化策略的效果可通过细胞密度、产量和特异性生产力（qP）直观体现（表 1）。例如，细胞系改造中，ExpiCHO-S™能使产量提升 2.5-6 倍；载体工程中，CR5 启动子的效率是 hCMV 的 3-4 倍；培养基优化中，小麦蛋白胨使 CHO-K1 细胞的产量提升 1.6 倍；辅助基因共表达中，EBNA-1 与 NDPK-A 组合能使产量提升 1.75-2.5 倍。这些数据证明，多策略联合使用（如细胞改造 + 低温培养 + 辅助基因共表达）能实现 “1+1>2” 的效果。

五、总结与展望

TGE 系统凭借短周期、易操作的优势，已成为生物药早期研发的核心工具。通过细胞系改造、载体工程、培养基优化等策略，其蛋白产量和质量已大幅提升，但仍面临批间差异、规模化生产效率不足等挑战。

未来，结合组学技术（基因组、转录组）和人工智能数据分析，有望精准找到影响 TGE 的关键因素，设计出 “量身定制” 的优化方案。例如，通过 AI 预测最佳培养基成分或转染条件，进一步缩短研发周期、降低成本。可以预见，随着技术的突破，TGE 系统将在生物制药产业中发挥更大作用，加速更多创新药从实验室走向临床。

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