赵惠民团队开发线粒体代谢去区室化策略，大幅提高琥珀酸合成产量

在微生物代谢工程领域，酵母因其强大的合成能力和工业化潜力，被广泛用于生产高附加值化学品。然而，传统真核细胞的代谢具有高度区室化特点，即关键辅因子如 NADH 和乙酰辅酶 A（acetyl-CoA）主要在线粒体中生成，而胞质中的辅因子供给往往不足，限制了酵母对于某些还原性代谢产物的高效合成。

例如，琥珀酸合成依赖的还原性三羧酸循环需要大量胞质 NADH，但受限于线粒体–胞质之间的传递效率，这一通路难以高效运行，成为制约其产率提升的瓶颈。

针对这一难题，美国伊利诺伊大学香槟分校赵惠民团队近日在 Nature Communications 上发表了一篇题为“Decompartmentalization of the yeast mitochondrial metabolism to improve chemical production in Issatchenkia orientalis”的研究成果。团队通过线粒体代谢的去区室化来进行辅因子工程改造，即将在线粒体中运行的关键代谢酶系迁移至胞质，以增强胞质中 NADH 和乙酰辅酶 A 的生成，从而提升目标产物的合成能力。团队利用该技术改造酵母菌 Issatchenkia orientalis（东方伊萨酵母）并实现胞质 NADH 供应的大幅增强，从而显著提升了琥珀酸及多种重要化学品的生物合成效率。

图｜区室化与去区室化策略示意图，以及如何利用去区室化策略增强琥珀酸生产

在天然酵母中，丙酮酸脱氢酶（PDH）复合体位于线粒体内，催化丙酮酸生成乙酰辅酶 A 与 NADH，是细胞获取还原力的重要来源。研究团队首先尝试引入大肠杆菌来源的 PDH 复合体（EcPDH），但活性较低。随后，他们改用引入东方伊萨酵母自身 PDH，研究人员从东方伊萨酵母的线粒体基因组中克隆了丙酮酸脱氢酶复合体的编码基因 PDA1、PDB1、LAT1、LPD1 和 PDX1，并通过生物信息学分析预测并删除这些蛋白的线粒体定位信号（MTS），使其得以在胞质中表达。

为确保 PDH 复合体在胞质中的正确组装和功能发挥，研究团队还特别引入了两种关键的辅助系统，如共表达枯草芽孢杆菌的脂酰蛋白连接酶（BsLpU），并添加微量硫辛酸作为辅助因子；以及建立了半合成脂酰化途径，引入弧菌的酰基载体蛋白合成酶与酿酒酵母的 ACP1、PPT2 基因，构建完整的脂酰化系统。Western blot 分析证实，改造后，丙酮酸脱氢酶（PDH）复合体亚基成功在东方伊萨酵母的胞质中表达并保持稳定。

代谢流分析显示，胞质 PDH 的表达使 NADH/NAD+ 比值提高了 1.8 倍，琥珀酸产量从基础菌株的 26.45g/L 提升至 31.47g/L。

图 | 在胞质中进行乙醛酸支路与 rTCA 途径的耦合，以增强琥珀酸产量

为了进一步提升碳效率与还原力利用率，研究团队在胞质中引入了一条乙醛酸支路。这一路径通过绕过 NADH 依赖的苹果酸脱氢酶（MDH）反应，使乙酰辅酶 A 能够通过柠檬酸、中间代谢产物乌头酸、异柠檬酸等转化为苹果酸，从而节省 NADH 消耗并提高碳转化效率，这一改造使工程菌株的琥珀酸产量由 31.47 g/L 进一步提升至 33.77 g/L。在此基础上，研究人员进一步对柠檬酸合酶（gltA）进行表达增强，构建了 EcGS-FF-gltA 菌株。该菌株在摇瓶发酵条件下实现了 39.22 g/L 的琥珀酸产量；在 5 L 生物反应器中，经过工艺优化，产量更是达到了 104 g/L，葡萄糖转化率提升至 0.85 g/g，突破了胞质 NADH 限制下的理论转化率（0.66 g/g）。

更重要的是，该“去区室化 + 支路增强”组合策略具有良好的通用性，在多种乙酰辅酶 A 衍生化学品的合成中表现出明显提升效果：柠檬苹果酸产量由 3.33 g/L 提升至 4.08 g/L，三乙酸内酯产量由 0.23 g/L 提升至 1.0 g/L，分别增长了 22% 与 335%。

为验证该策略的工业可行性，研究团队还在玉米浆等廉价碳源、低 pH（pH=3）发酵条件下进行了评估。结果显示，EcGS-FF-gltA 菌株在此条件下仍能实现 101.86 g/L 的琥珀酸产量，生产速率达 0.94 g/L/h，且副产物极低，表明该菌株具备良好的过程稳定性与放大潜力。进一步的技术经济分析指出，该策略可将琥珀酸生产成本由 1.30 美元/kg 降至 0.97 美元/kg，显著优于传统石化合成路线，具备明确的工业替代优势。

总体而言，本研究提出的线粒体代谢去区室化策略不仅成功突破了真核酵母细胞器代谢分隔对 NADH 与乙酰辅酶 A 供应的限制，从结构层面重构胞质中高效的能量与碳源网络，还通过实验证明其在多个乙酰辅酶 A 衍生产物合成中的广谱适用性与工业化前景。未来，该平台技术可进一步拓展至其他高附加值化学品的绿色制造，推动生物基经济的可持续发展。

参考文献：

1. Tran, V.G., Tan, SI., Xu, H. et al. Decompartmentalization of the yeast mitochondrial metabolism to improve chemical production in Issatchenkia orientalis. Nat Commun 16, 7110 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-62304-w

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