《食品科学》：浙江大学冯凤琴教授、浙江海洋大学黄菊副教授等：酪蛋白源肽TPTLN助睡眠作用及其机制

长期以来，牛奶一直被认为是天然的助眠剂，这主要是因其含有极高的色氨酸和褪黑素。此外，牛奶的主要蛋白质成分酪蛋白也有助于促进睡眠。研究表明，酪蛋白酶解会产生具有多种生物活性的肽。目前已经有多项研究表明，牛乳酪蛋白来源的生物活性肽可以起到安神助眠的功效。本课题组前期通过液相色谱-串联质谱分析，并利用Schrodinger软件将分析得到的肽段与GABA A 受体蛋白6HUO进行批量分子对接，最终发现了诺衍®酪蛋白水解物中有一种具有助睡眠活性的五肽TPTLN。前期研究表明，苯二氮卓位点主要由6 个主要的氨基酸残基（His102、Asn60、Phe100、Tyr58和Tyr160）组成。氢键和亲脂性接触是形成稳定的肽-GABA A 受体复合物的主要相互作用力，研究表明酪蛋白水解物来源的YPVEPF和YFYPEL激活GABA的能力主要依赖于N端的酪氨酸和GABA A 受体中的His102、Ser205以及Thr142残基形成重要的氢键。分子对接结果显示，TPTLN与GABA A 受体的结合位点分别为Ser205、Asn60、Tyr210、Glu138、Thr207、Lys156、Asn103和Ser195（图1），根据结果推测其可能具有潜在的助睡眠功效。

浙江海洋大学食品与药学学院邓世洁，黄菊*和浙江大学生物系统工程与食品科学学院的冯凤琴*等人通过合成五肽TPTLN，以地西泮为阳性对照，对比验证TPTLN的助睡眠活性，并探究其可能的作用机理。旨在为开发乳源酪蛋白水解物相关的助睡眠功能性食品提供实验依据，为酪蛋白源肽的实际应用奠定基础。

01

TPTLN对小鼠体质量的影响

小鼠体质量在一定程度上能反映小鼠的生长状况。适应期称质量后，将30 只小鼠分配至6 个笼子中，5 只/笼，使每笼小鼠体质量均等，给药期间每天称质量（给药前）。如图2所示，给药期间小鼠的状态正常、精神状态良好，进食量、饮水量稳定，给药前各组体质量无显著差异。给药期间地西泮组体质量出现明显的下降趋势，其中第3、4、7、8、9天与对照组相比具有显著差异（

P

＜0.05、

P

＜0.01）。这可能是由于地西泮的助眠作用导致小鼠睡眠时长延长，进食时间缩短，从而使其体质量下降。TPTLN组小鼠体质量与对照组相比无显著差异。

02

TPTLN对戊巴比妥钠诱导睡眠行为的影响

通过戊巴比妥钠睡眠行为学实验探究TPTLN协同戊巴比妥钠对小鼠睡眠的影响，结果如图3所示。地西泮组的睡眠潜伏期（（251.0±14.0）s）相比于对照组（（524.4±76.7）s）高度显著缩短52.1%（

P

＜0.001）（图3B）；同时延长睡眠时长至（3 247.0±422.5）s（

P

＜0.000 1），是对照组（（973.8±128.5）s）的3.3 倍（图3C）。此外，TPTLN组小鼠的入睡率达到100%，与地西泮组的效果相当（图3A）；同时与对照组相比，TPTLN也显著缩短小鼠的睡眠潜伏期至（358.3±14.7）s（

P

＜0.05），相比对照组缩短了31.7%（图3B）；TPTLN显著延长小鼠睡眠时长至（2 054.0±125.5）s（

P

＜0.05），是对照组的2.1 倍（图3C）。结果表明，TPTLN具有良好的助睡眠功能。

03

TPTLN对小鼠血清中神经递质含量的影响

如图4A所示，在TPTLN的干预下，小鼠血清中的5-HT质量浓度与对照组相比无显著差异，但地西泮却极显著下调了血清中5-HT的质量浓度（

P

＜0.01），相比于对照组下调了23.3%。如图4B所示，与对照组相比，地西泮和TPTLN均显著提高了小鼠血清中的GABA质量浓度（

P

＜0.05，

P

＜0.001），其中TPTLN组小鼠血清中的GABA质量浓度达到（211.5±20.9）pg/mL，提高了49.4%。如图4C所示，5-HT的代谢产物5-羟基吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA）的质量浓度变化趋势与5-HT相似，地西泮组、TPTLN组的5-HIAA质量浓度均略有下降，但无显著差异。此外，小鼠血清中Glu的质量浓度在地西泮和TPTLN的干预下均有所下降，相比于对照组分别下降了3.5%和10.0%（图4D）。如图4E所示，在TPTLN的干预下，GABA/Glu比值相比于对照组高度显著升高了68.8%（

P

＜0.001），地西泮组相比对照组也有上升的趋势，但无显著差异。

另一方面，与对照组相比，地西泮组小鼠血清中

-内啡肽（

-endorphin，

-EP）的质量浓度有所下降，而TPTLN组小鼠血清中

-EP的质量浓度与对照组持平（图4F）。皮质醇作为一种周期性、节律性分泌的激素，在血清中的浓度于凌晨达到最低、早晨达到峰值。如图4G所示，小鼠血清中皮质醇的质量浓度在TPTLN的干预后有所升高，相比于对照组上升了8.5%，这可能与皮质醇的复杂昼夜分泌节律有关。此外，小鼠血清中去甲肾上腺素（noradrenaline，NE）的质量浓度在TPTLN的干预后未发生显著变化，在地西泮干预后极显著下降了11.6%（

P

＜0.01）（图4H）。

04

TPTLN对小鼠脑组织中神经递质含量的影响

在神经元水平上，脑中的特定区域如下丘脑、脑干和丘脑，与5-HT、GABA等神经递质相互作用，进而促进或抑制睡眠。与对照组相比，地西泮未能提高小鼠脑组织中5-HT、GABA的质量浓度，在TPTLN干预后小鼠脑组织中5-HT、GABA的质量浓度分别升高了7.6%和10.6%，但并无显著差异（图5A、B）。在地西泮、TPTLN的干预下，5-HT代谢产物5-HIAA的质量浓度呈现与5-HT相似的趋势，也与对照组无明显差异（图5C）。如图5D、E所示，经地西泮、TPTLN干预后Glu的质量浓度均有所下降，尤其是TPTLN组相比于对照组下降了7.5%；同时小鼠脑组织中GABA/Glu的比值也均有所升高，尤其是TPTLN组相比于对照组明显升高了19.3%（

P

＜0.000 1）。

如图5G、H所示，相比于对照组，TPTLN显著降低了小鼠脑组织中皮质醇和NE的质量浓度（

P

＜0.05），分别下降了24.3%和23.4%。而各组小鼠脑上清中

-EP的质量浓度无明显差异（图5F）。因此可以推测，TPTLN的协同助睡眠作用可能主要是通过改善GABA/Glu的抑制/兴奋代谢失衡、调节5-HT的合成与代谢、降低皮质醇和NE的水平实现。

05

TPTLN对小鼠下丘脑中mRNA表达水平的影响

为了进一步探究TPTLN调节相关神经递质的机制，从基因层面测定GABAA受体和5-HT受体mRNA的表达水平，以检测TPTLN是否影响转录过程。如图6A所示，与对照组相比，在TPTLN的干预下GABA的转录水平极显著升高（

P

＜0.01），是对照组的1.5 倍。如图6B所示，5-HT的转录水平也在TPTLN的干预下显著升高（

P

＜0.05），是对照组的1.3 倍。根据实验结果推测TPTLN可能通过提高

GABA

A

-α1

5-HT1A

表达水平抑制神经元细胞的激动，以实现助睡眠功能和神经调控。

06

讨论与结论

本研究通过戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠实验探究酪蛋白源五肽TPTLN的助睡眠活性。有研究表明，增强戊巴比妥钠诱导睡眠的物质具有中枢作用的促进睡眠特性。在戊巴比妥钠诱导的行为学实验中，地西泮提高了小鼠的入睡率，同时显著缩短了睡眠潜伏期、延长了睡眠时间。TPTLN也显著缩短了小鼠的睡眠潜伏期、延长了睡眠时间，且其干预后的小鼠入睡率与地西泮组相当，达到了100%。结果表明，TPTLN具有良好的助睡眠活性。

为了进一步探究TPTLN协同戊巴比妥钠助睡眠的作用机制，通过ELISA对小鼠血清和脑组织中神经递质的含量进行测定。5-HT、GABA、Glu等神经递质的水平以及GABA/Glu的平衡可用于评估睡眠状况。本研究结果表明，与对照组相比，TPTLN高度显著提高了小鼠血清中GABA的质量浓度，降低了Glu的质量浓度，同时明显提高了小鼠血清和脑组织中GABA/Glu的比值，而在地西泮的干预下，GABA/Glu的比值虽有升高，但无显著变化。GABA是主要的抑制性神经递质，大脑中几乎所有的神经元都对GABA有反应。在中枢神经系统中，Glu是主要的兴奋性神经递质，在保持神经系统的兴奋及觉醒方面起关键作用。谷氨酸脱羧酶可以促使体内的兴奋性神经递质Glu转化为抑制性神经递质GABA，因此GABA与Glu之间的平衡，与睡眠质量关系密切。TPTLN上调了小鼠脑组织中5-HT的水平，而血清中并未发现明显差异，这样的趋势在5-HIAA的检测中也同样存在。5-HT是另一种重要的抑制性神经递质，缺乏5-HT可能导致失眠。但也有研究表明，5-HT可参与上行激活系统，抑制快速眼动睡眠，且高水平的5-HT可导致失眠。另有研究发现5-HT受体激动剂会促进失眠模型大鼠觉醒，抑制快速眼动睡眠和非快速眼动睡眠，且不同区域的5-HT神经元对睡眠的影响不同。因此，5-HT在睡眠的作用机制方面还有待深入研究。5-HIAA是5-HT的主要代谢产物，其含量的改变也反映了5-HT的变化。与对照组相比，TPTLN显著降低了小鼠脑组织中NE的质量浓度，但在小鼠血清中并无明显差异。NE是一种单胺类神经递质，可调节睡眠和觉醒，其水平呈现周期性波动，大脑中NE的浓度与快速眼动睡眠的持续时间呈负相关。同时与对照组相比，TPTLN显著降低了脑组织中皮质醇的水平，说明TPTLN具有良好镇静、助眠、调节昼夜节律的作用。但值得注意的是，TPTLN组小鼠血清中的皮质醇水平显著升高。皮质醇是一种因压力而释放的肾上腺激素，它是睡眠剥夺或昼夜节律紊乱时的生物标志物。觉醒后30 min皮质醇急剧增加和出现峰值的现象被称为皮质醇觉醒反应（CAR），由此猜测小鼠血清中的皮质醇升高可能是由CAR引起。同时也有研究表明，总睡眠时间与清醒时的皮质醇水平无关，也与CAR无关。β-EP是一种内源性吗啡样物质，血清中的β-EP可以穿过血脑屏障，使小鼠产生类似阿片的镇静效果。β-EP含量的增加可以起到一定的助睡眠作用。但在本实验小鼠血清和脑组织中β-EP的检测中，其质量浓度并未发现明显变化。由此可以推测，TPTLN的助睡眠作用可能主要是通过调控GABA和Glu的动态平衡、调节5-HT的合成与代谢、降低脑内NE、皮质醇的水平介导。

基于以上实验结果，推测地西泮与TPTLN的作用靶点不同。GABAA是GABA信号通路的关键靶点。GABA与其受体结合后，可增强氯化物在神经细胞膜上的通透性。这种氯离子的流入会诱导膜超极化，随后降低兴奋性水平，同时产生镇静、催眠和抗焦虑作用。这种抑制作用可以抵消觉醒神经递质和神经元兴奋，最终改善睡眠质量。GABAA-

1亚基和5-HT1A对调节大脑中的神经递质系统至关重要。有研究表明，地西泮主要通过作用于GABA A -

2亚基影响睡眠和脑电模式，而不是GABA A -

1亚基。此外，5-HT受体是大脑血清素系统中的关键蛋白质，能够调节5-HT和其他神经递质的释放，5-HT1A是脑内分布最广的5-HT受体亚型。有研究表明，5-HT1A可以通过抑制神经元Glu介导的兴奋信号通路，同时提高神经元GABA受体的基因转录水平，以达到镇静和催眠作用。因此，本研究进一步通过qPCR检测TPTLN是否影响

GABA

A

5-HT1A

基因的表达。结果显示，TPTLN显著提高了小鼠下丘脑中

GABA

A

-α1

5-HT1A

的mRNA表达水平。由此表明，与地西泮不同，TPTLN可以通过作用于GABA A -

1、5-HT1A抑制神经元细胞的激动，发挥其镇静助眠的作用。

值得注意的是，具有良好助睡眠作用的酪蛋白源肽TPTLN的N端并不是酪氨酸。Chen Yuanyuan等报道了4 条新酪蛋白水解物来源的助睡眠肽段，其中有3 条肽的序列中不含有酪氨酸。因此推测，酪蛋白源的助睡眠肽N端酪氨酸并不一定起决定作用。

本文《酪蛋白源肽TPTLN助睡眠作用及其机制》来源于《食品科学》2025年46卷第3期119-127页，作者：邓世洁，刘玲，黄菊*，冯凤琴*，赵敏洁，杜鹃。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240617-111。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：普怡然；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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