《食品科学》：宁夏大学李亚蕾教授等：秦川牛宰后成熟过程中细胞自噬与肉色变化的相关性

在肉类加工与贮藏过程中，宰后成熟是一个至关重要的阶段，它不仅影响肉类的感官品质，还直接关系到消费者的接受度和市场价值。秦川牛作为中国优秀的肉牛品种，其肉质鲜美、营养丰富，深受市场欢迎。然而，在秦川牛宰后成熟过程中，肉色作为评价肉质新鲜度和品质的重要指标之一，其变化机制尚未完全阐明。近年来，细胞自噬作为细胞内一种重要的降解与再循环过程，在肉类宰后成熟及品质变化中的作用逐渐受到关注。

肉色的变化主要由肌红蛋白的含量及其存在状态决定。宰后，随着氧气供应的中断和代谢活动的进行，肌红蛋白逐渐转化为高铁肌红蛋白（MetMb）和脱氧肌红蛋白（DeoMb），导致肉色由鲜红色变为暗褐色。这一过程中，细胞自噬可能通过影响肌红蛋白的稳定性、降解速率以及与其他蛋白质的相互作用，从而调控肉色的变化。此外，宰后成熟过程中细胞自噬与肉色变化之间的相关性还可能受到多种因素的影响，如温度、pH值、微生物活动等。这些因素不仅直接影响肉类的贮藏稳定性和品质变化，还可能通过调控细胞自噬的发生和强度，间接影响肉色的变化。

因此，宁夏大学食品科学与工程学院的梁燕群、司健芳、李亚蕾*等旨在探讨秦川牛宰后成熟过程中细胞自噬与肉色变化的相关性。采用蛋白免疫印迹（WB）法检测细胞自噬关键蛋白的表达量变化，通过测定宰后不同时间点细胞ATG的表达量、肌红蛋白的含量及其衍生物的比例，再测定活性氧（ROS）、线粒体膜电位（MMP）和还原酶活性等指标，结合肉色参数的测定和分析，揭示细胞自噬在秦川牛宰后成熟过程中对肉色变化的调控机制。这不仅有助于深入理解肉类宰后成熟的生化过程，还可为优化肉类加工和贮藏工艺、调控宰后肉色、提高肉类品质提供理论依据和实践指导。

1 秦川牛宰后成熟过程中肉色的变化

由图1可知，在宰后成熟期间，亮度（

L

*值）和红度（

a

*值）整体变化趋势均随宰后成熟时间的延长呈先上升后下降的趋势，且在96 h达到最大值。

L

a

*值先增加的原因是宰后代谢加速使蛋白质结构排列散乱，这一过程使光分散度增加，同时，肌红蛋白被氧化成OxyMb，使肉呈鲜红色。

L

a

*值下降的原因是OxyMb被氧化并转变为MetMb，并使肉色变暗。在宰后

b

*值呈缓慢上升的趋势（

P

＜0.05），这可能是由于长时间的贮藏使肌肉与脂肪能够充分接触，肌肉中的脂肪被不断氧化，加上积累的MetMb在可见光下呈现棕色或灰色，从而使b*值增加，整体趋势与胡丽筠等的研究结果一致。

2 秦川牛宰后成熟过程中3 种肌红蛋白相对含量的变化

由图2可知，宰后成熟期间DeoMb相对含量下降较为缓慢，OxyMb相对含量明显下降，MetMb相对含量明显上升，这一变化与张萌对不同贮藏期的牛肉研究结果基本一致。活体内，DeoMb与OxyMb、MetMb可相互转化，DeoMb在有氧条件下转化为OxyMb，OxyMb在有氧条件下进一步转化为MetMb，而MetMb还原为OxyMb和DeoMb需要一定的条件，比如能量的维系以及细胞环境的稳定。本研究中MetMb相对含量上升可能是由于宰后成熟时间延长，细胞环境发生变化，同时肌肉中氧含量降低，细胞自噬和氧化应激同时发生，ATP大量消耗，无法维持还原反应的发生，最终导致肉色变差。

3 秦川牛宰后成熟过程中MRA的变化

在维持肉色稳定性的机制中，MRA于MetMb的还原系统中扮演着重要角色。通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的作用，MRA能够将MetMb有效还原为OxyMb，进而促进肉色的稳定与提升。由图3可知，贮藏0～96 h内，MRA缓慢下降（

P

＜0.05），96～192 h内，MRA显著下降（

P

＜0.05），这可能是由于宰后贮藏时间的延长，使肌红蛋白卟 啉环上Fe 3+ 的外层 电子在肌肉脂肪氧化产 生自由基过程中发生了跃变，从而导致了MetMb还原酶活性下降，且有研究指出MetMb还原酶活性的下降与肌红蛋白氧化还原反应发生时电子的传递有关。

4 秦川牛宰后成熟过程中ROS含量的变化

ROS是一种参与肌肉组织和细胞氧化应激过程的信号分子。由图4可知，ROS含量在0～2 h降低，2～192 h显著升高（

P

＜0.05）。0～2 h ROS含量降低与肌肉细胞中抗氧化酶的存在有关，抗氧化酶系统在宰后成熟早期可以消除部分ROS，因此宰后早期含量降低。2～192 h ROS含量的上升可能由于氧化防御系统和抗氧化防御系统之间的稳态会随着细胞内环境的改变而发生变化，抗氧化酶的活性被抑制，氧化还原系统被破坏，活性下降的抗氧化酶系统难以消除新产生的ROS，导致ROS积累，因此，秦川牛宰后成熟过程中ROS水平增加表明该过程氧化应激加剧和肌肉抗氧化能力下降，与Zhang Jiaying等的研究结果一致。

5 秦川牛宰后成熟过程中MMP的变化

MMP与线粒体膜通透性密切相关，并且受到线粒体膜通透性的调节，其升高或降低可以反映线粒体损伤情况。由图5可知，MMP在0～48 h显著下降（

P

＜0.05），在宰后48～192 h下降缓慢，由此可知，当牛肉宰后细胞受到缺氧等环境刺激时，MMP的变化主要发生在宰后初期，此时肌肉细胞中环境紊乱且发生了氧化应激，与Zhang Ping等的研究结果一致。

6 秦川牛宰后成熟过程中Beclin1表达水平的变化

Beclin1是III类磷脂酰肌醇-3激酶VPS34复合物中的主要分子之一及ATG家族中至关重要的调节元素，也是首个在哺乳动物体内被确认参与并介导自噬过程的蛋白。由图6可知，Beclin1条带在宰后成熟过程中均存在，且其表达呈先上升后下降的趋势，0～96 h蛋白表达量呈现上升趋势的原因是此时细胞内的自噬活动较强，96～192 h，Beclin1含量减少，这可能是由于腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/雷帕霉素靶点蛋白（mTOR）/Unc-51样激酶1（ULK1）通路的作用，随着宰后时间的延长，mTOR的抑制作用逐渐增强，导致AMPK和ULK1的活性降低，从而抑制细胞自噬的发生，使得Beclin1的表达量下降。Beclin1表达上升可减缓在宰后初期对牛肉细胞造成的线粒体损伤程度并改善细胞功能，使细胞存活时间延长，这与Rubio-González等研究Beclin1在猪宰后早期呈上升的趋势一致。有研究表明，Beclin1表达下调对细胞存活和线粒体功能的影响是细胞自主的行为，Beclin1表达下调会造成宰后后期牛肉细胞中缺陷的自噬体/自噬酶体的积累，同时，凋亡因子活性可能会增强，通过抑制Beclin1蛋白表达影响自噬，从而下调自噬，与Tie Huaimao等的研究一致。或是因为自噬强度过高反而影响细胞生存，细胞会抑制此时的自噬。

7 秦川牛宰后成熟过程中LC3-II表达水平的变化

LC3-II作为一种自噬体标记物在自噬细胞死亡期间被募集到吞噬细胞膜上，被认为是自噬活动的特异性标志。García-Macía等通过对提取宰后成熟的牛肉进行WB分析也发现LC3-II条带的存在。Rubio-González等发现改变猪肉在宰后成熟期间的储存条件，LC3-II条带也都存在。以上两个研究均表明在动物宰后成熟过程中发生了细胞自噬活动，本研究也发现在秦川牛肉宰后成熟过程中有LC3-II条带，因此，秦川牛在宰后成熟期间可能也发生了细胞自噬。由图7可知，LC3-II的表达在0～96 h呈上升趋势，早期增加可能与Beclin1的介导作用密不可分，Beclin1是自噬形成的必需分子，介导ATG定位于自噬泡，调节自噬相关基因蛋白并参与自噬的过程。此外，在自噬体膜形成过程中，前期LC3可能被切割成LC3-I，LC3-I与磷脂酰乙醇胺结合形成LC3-II，其含量与自噬泡数量呈正比。LC3-II的表达在96～192 h呈下降趋势，在自噬体形成后，LC3-II发生聚集并定位于自噬体膜上。当溶酶体将自噬体融合并降解时，LC3-II可重新脂质化为LC3-I，本研究结果与Zhu Xijin等的研究一致。

8 秦川牛宰后成熟过程中ATG7表达水平的变化

ATG7作为一种自噬调节的核心蛋白，扮演着泛素化E1样连接酶的角色，对于推动LC3-I向LC3-II的转化过程至关重要，同时也促进了ATG5与ATG12之间的紧密结合，其存在是诱导自噬发生的先决条件。ATG7是骨骼肌发育适应细胞内环境所必需的蛋白之一。由图8可知，在宰后成熟期间，ATG7在0～96 h呈显著上升趋势，此过程中ATG7会加快自噬体-溶酶体融合后的内自噬体膜形成速率，促使自噬增强，与Wang Linjie等发现鸡肉在宰后初期ATG7蛋白表达也呈上升的趋势一致。在96～192 h呈急速下降趋势，这是因为秦川牛宰后后期能量不足，无法形成由ATG7蛋白和受损线粒体结合而成的自噬小体，ATG7表达下调会通过改变葡萄糖消耗和乳酸产生过程，促进糖酵解过程，产生小部分能量，同时也会导致肌肉质量下降、线粒体异常等情况发生。综上，ATG7参与秦川牛宰后成熟过程中的自噬过程，其表达水平变化趋势为先升高后降低。

9 秦川牛宰后成熟过程中p62表达水平的变化

p62不仅是诱导氧化应激的蛋白，也是一种选择性的自噬受体，通常参与泛素化蛋白质的自噬清除，与其运送的蛋白一起被降解。在自噬中，p62的表达随着自噬的增强而逐渐降低，通常与自噬活性呈负相关。由图9可知，p62条带在宰后成熟期间较浅，其原因是宰后有其他自噬受体的存在，p62的缺失已被证明对自噬的影响不大。

宰后0～96 h，p62的相对表达量呈缓慢下降趋势，在96～192 h呈显著上升趋势，p62蛋白表达量升高，这通常作为反映细胞自噬受到破坏或抑制的一个信号。在自噬体的早期构建阶段，p62扮演了至关重要的角色，它作为一座桥梁，精确地连接着泛素化修饰的蛋白质与自噬体膜上的LC3蛋白，之后被特异性地包裹进自噬体，并在自噬溶酶体内被其中的蛋白水解酶降解。因此，p62蛋白的表达水平实际上可作为衡量自噬活性高低的反向指标，即p62蛋白表达量的增加往往表明自噬活性减弱，反之亦然。本研究结果与Wang Tongting等研究发现骨骼肌细胞中p62在宰后0、4、7 d呈先下降后上升的结果一致。

10 秦川牛宰后成熟过程中caspase 8表达水平的变化

Caspase 8参与细胞凋亡的起始，主要通过外源性途径启动细胞凋亡，也可以通过蛋白诱导内源性途径的激活。由图10可以看出，随着宰后成熟时间的延长，caspase 8呈先下降（0～96 h）后上升（96～192 h）的趋势。caspase 8对自噬具有抑制作用，可切割对自噬开始和/或成熟至关重要的底物。Duan Jiaxin等测定猪卵母细胞中的自噬活性时发现，使用自噬激活剂可以促进细胞成熟，降低caspase 8活性，从而减缓细胞凋亡。由此可知，自噬增强时，caspase 8活性会减弱。本研究结果与Liu Jun等研究宰后猪肉成熟过程中caspase 8表达变化的趋势一致。在正常状态下，细胞自噬和细胞凋亡共同维持代谢平衡，由本实验结果推测秦川牛宰后贮藏过程中细胞自噬和凋亡的强度转变主要发生在96 h节点处。

11 宰后成熟过程中细胞自噬、凋亡关键蛋白及肉色指标之间的相关性分析

如表1所示，除LC3-II与caspase 8之间无明显相关性外，其余蛋白相互之间均极显著相关（

P

＜0.01）。Beclin1与LC3-II、ATG7呈极显著正相关（

P

＜0.01），相关系数

r

分别为0.671、0.748，与p62、caspase 8呈极显著负相关（

P

＜0.01），

r

分别为-0.767、-0.925；LC3-II与ATG7呈极显著正相关（

r

＝0.953，

P

＜0.01），与p62呈极显著负相关（

r

＝-0.802，

P

＜0.01）；ATG7与p62、caspase 8均呈极显著负相关（

P

＜0.01），

r

分别为-0.901、-0.588；p62与caspase 8呈极显著正相关（

r

＝0.699，

P

＜0.01）。Beclin1、LC3-II、ATG7、p62、caspase 8之间存在密切关系，这与Weng Xiaoyuan等的研究结果一致。

自噬过程在线粒体中尤为关键，在缺氧环境下，该过程可促进受损线粒体被清除，维持细胞稳态与生存。在细胞面临缺氧挑战时，自噬机制被激活，特异性靶向并清除功能受损的线粒体，这一精细调控不仅促进了能量再平衡，还增强了细胞对缺氧环境的适应与生存能力。细胞自噬主要发生于宰后初期，且能量物质和线粒体相关蛋白在宰后初期发挥的作用更为显著，故将宰后初期（0～96 h）和宰后中后期（96～192 h）分开分析。

由图11可知，在0～96 h，MMP与Beclin1、ATG7呈极显著正相关（

r

＝0.86、0.85，

P

＜0.01），与LC3-II呈极显著正相关（

r

＝0.65，

P

＜0.01），与p62、caspase 8呈极显著负相关（

r

＝-0.82、-0.85，

P

＜0.01），由此可见，细胞自噬的发生有利于MMP的维持；ROS与Beclin1、LC3-II、ATG7呈极显著正相关（

r

＝0.95、0.80、0.89，

P

＜0.01），与p62、caspase 8呈极显著负相关（

r

＝-0.80、-0.93，

P

＜0.01）；色度值

L

a

b

*值均与Beclin1、LC3-II、ATG7呈极显著正相关（

P

＜0.01），与p62、caspase 8呈极显著负相关（

P

＜0.01），表明细胞自噬可对肉色起到正向调控作用；DeoMb、OxyMb与Beclin1、LC3-II、ATG7呈极显著负相关（

P

＜0.01），与p62、caspase 8呈极显著正相关（

P

＜0.01）；MetMb与Beclin1、LC3-II、ATG7呈极显著正相关（

r

＝0.98、0.86、0.94，

P

＜0.01），与p62、caspase 8呈极显著负相关（

r

＝-0.84、-0.98，

P

＜0.01）；MRA与Beclin1、LC3-II、ATG7呈极显著负相关（

r

＝-0.90、-0.84、-0.93，

P

＜0.01），与p62、caspase 8呈极显著正相关（

r

＝0.91、0.90，

P

＜0.01），这可能是由于牛肉中细胞自噬提供的能量不足以对抗还原型辅酶I自身的减少量，MRA的还原力下降，MetMb积累进而导致牛肉肉色发生劣变。

由图12可知，在96～192 h成熟期内，

L

*值与MMP呈显著负相关（

P

＜0.05）；

a

*值与Beclin1、ATG7呈极显著正相关（

P

＜0.01），与LC3-II呈显著正相关（

P

＜0.05）；

b

*值与MMP呈极显著正相关（

P

＜0.01）；随贮藏时间的延长，宰后中后期各指标之间的相关性大幅度降低，自噬活动明显减弱，此时细胞内的微环境遭到破坏，氧化应激加剧，线粒体功能异常，细胞内的氧化还原反应等过程受到严重影响。

讨论与结论

一般情况下，自噬是一种有益的应激反应，在能量不足或生长因子缺乏期间显著上调，有助于维持细胞结构和功能，并为细胞存活提供能量；另一方面，明显的自噬可以作为细胞凋亡的触发因素。秦川牛宰后成熟过程中Beclin1、LC3-II、ATG7、p62均是重要的自噬因子，其中Beclin1是参与细胞自噬起始的关键蛋白；LC3-II是判断细胞自噬变化的重要蛋白；caspase 8是凋亡启动子。秦川牛宰后成熟过程中自噬和凋亡关键因子均表达，于96 h达到峰值，持续到宰后192 h。研究表明，自噬因子可以通过下调caspase 8介导的凋亡而发挥重要作用，也可与部分蛋白相互作用转位到线粒体，它们通过相互作用介导自噬体对线粒体的隔离，导致线粒体自噬。Haseeb等研究发现，抑制线粒体自噬会使线粒体嵴的形态受损，而线粒体嵴的状态显著影响电子传递过程和氧化还原酶的活性，进而对肉色产生直接影响。

在秦川牛宰后初期，随着Beclin1、LC3-II、ATG7表达的增加以及p62、caspase 8蛋白表达的减少，自噬过程逐渐增强，凋亡逐渐减弱。到宰后中后期恰好相反，Beclin1、LC3-II、ATG7表达量逐渐减少，p62、caspase 8蛋白逐渐增加，自噬过程逐渐减弱，凋亡逐渐增强。因此，猜测牛肉细胞的宰后成熟过程可能涉及从自噬到凋亡的转变。Choi等发现自噬因子表达上调可能在促进自噬的同时抑制了caspase 8的激活，有助于改善缺氧情况下的细胞凋亡，自噬因子下调会通过促进细胞凋亡和减缓线粒体自噬从而缩短细胞存活的时间，这与本研究趋势相符。

正常的MMP及ROS水平是维持线粒体生理功能所必需的，而两者发生的显著变化表明肌肉细胞中发生了氧化应激。在宰后肌肉中，ROS积累会加剧氧化应激，破坏线粒体膜，并促进线粒体降解，导致脂质氧化增加，颜色稳定性降低。在宰后牛肉缺血、缺氧的条件下能量大幅下降，线粒体中ROS的积累可能导致线粒体损伤，也有研究表明，ROS是自噬的关键调节因子，ROS参与自噬的诱导，自噬也会控制ROS水平，两种反应之间存在制衡，在本实验中，随成熟时间的延长，DeoMb、OxyMb、MetMb的动态平衡机制逐渐被打破，MRA活性持续降低，ROS水平对肉色产生的负向调控显著高于细胞自噬对肉色的影响。在Wang Linlin等的研究中，分别对ROS进行氧化和清除处理后，ROS介导的氧化应激通过线粒体凋亡途径对肉品质造成影响，与本研究结果一致。

综上，细胞自噬从宰后初期被激活后便持续发挥作用，宰后贮藏期间秦川牛肉中细胞自噬的发生有利于线粒体内肌红蛋白还原反应的进行，进而正向调控肉色，但当细胞面临氧化应激和凋亡过程时，线粒体的膜电位和自由基含量发生变化，MRA有效转化MetMb为还原态的能力减弱，导致MetMb逐渐累积，最终促使肉色发生劣变。

本文《秦川牛宰后成熟过程中细胞自噬与肉色变化的相关性》来源于《食品科学》2025年46卷第3期27-35页，作者：梁燕群，司健芳，马萌，高爽，李亚蕾*，罗瑞明。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240730-292。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：林安琪；责任编辑：张睿梅。点击下方 阅读原文 即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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