《食品科学》南京农业大学赵立艳教授等：杏鲍菇多肽的分离纯化、结构表征及免疫活性

人体免疫系统由3 道防线构成，其中第3道防线主要由免疫器官和免疫细胞所组成。巨噬细胞作为一种重要的免疫细胞，能够有效地执行吞噬作用，并通过分泌细胞因子来调节体内的免疫反应，Toll样受体（TLRs）是重要的跨膜识别受体，在巨噬细胞的免疫调节中发挥着重要作用。细胞因子可通过上调抗原呈递细胞表面的共刺激信号直接或间接刺激其他免疫细胞（如T细胞、B细胞）的活化和增殖，从而增强整体的免疫应答，然而，过多的细胞因子则会引起炎症，因此，控制细胞因子的分泌对机体的免疫调节至关重要。一些研究发现了针对TLR4的双向免疫调节因子。

食用菌富含多种生物活性成分，如多糖、蛋白质、多肽等都具有免疫调节活性。杏鲍菇（

Pleurotus eryngii

南京农业大学食品科技学院的田江榕、海南大学食科学与工程学院的仲磊、南京农业大学食品科技学院的赵立艳*等旨在分离、纯化并鉴定杏鲍菇中的免疫调节肽，通过分子对接和分子动力学模拟技术研究其与TLR4蛋白的作用机制。通过体外模拟胃肠道消化酶解杏鲍菇粗蛋白，进一步通过超滤分离、Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱层析及高效液相色谱法分离纯化杏鲍菇多肽，同时构建RAW264.7巨噬细胞模型对其免疫调节活性进行筛选，采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对免疫调节活性肽进行结构表征。采用计算机模拟分子对接探究目标多肽序列与TLR4-MD2蛋白的相互作用位点，以预测其免疫促进活性，并使用MD法分析其结构稳定性。本研究将为食用菌免疫调节活性肽的深入发掘提供理论依据。

1 杏鲍菇肽的分离纯化及其免疫活性评价

1.1 超滤分离组分的免疫活性

均如图1a所示，CS表面呈现片状结构且存在少量裂纹，无多孔结构，不利于吸附焦糖色素。而QCSA（图1b）呈现明显的多孔结构，其丰富的孔隙结构有利于暴露更多吸附活性位点，用于高效捕获焦糖色素。

巨噬细胞通过分泌促炎细胞因子（如TNF-α和IL-1β）以及抗炎细胞因子（如IL-10）调控免疫反应。针对病原体的刺激，巨噬细胞能够通过吞噬作用清除死亡细胞和细胞碎片，并产生NO调节T细胞反应以保持机体免疫防御和组织稳态。本研究将分离的杏鲍菇肽组分作用于RAW264.7细胞，并测定其增殖率、NO释放率、吞噬率和细胞因子mRNA表达量，对各组分进行筛选。杏鲍菇蛋白酶解液经过超滤分离后获得4 种不同分子质量的多肽组分，即＞10、5～10、3～5 kDa和＜3 kDa。与空白对照组相比（图1A），不同分子质量的杏鲍菇多肽对RAW264.7细胞的活性没有明显影响（P＞0.05），这表明杏鲍菇多肽不会对RAW264.7巨噬细胞造成毒性损伤。吞噬作用是摄入和消除微生物病原体和凋亡细胞的基本过程，对组织免疫稳态至关重要。中性红吞噬能力常用来检测巨噬细胞吞噬功能，可以间接反映机体的非特异性免疫水平。与空白对照组相比，分子质量在＞10、5～10 kDa和3～5 kDa范围内的杏鲍菇多肽没有明显促进RAW264.7巨噬细胞吞噬作用，而＜3 kDa的杏鲍菇多肽显著（P＜0.05）提高了RAW264.7巨噬细胞的吞噬能力，其中性红吞噬率达到（118.328±5.290）%，这表明小分子杏鲍菇多肽在启动和调节巨噬细胞免疫应答方面具有重要作用，相关研究显示小分子多肽能通过与细胞表面的模式识别受体如TLRs结合，激活细胞内信号转导，并触发MAPK和NF-κB等关键信号通路，从而促进巨噬细胞的吞噬功能。NO是由一氧化氮合酶通过L-精氨酸产生，并由巨噬细胞相应病原体释放，因此NO释放量的增加是一种表征巨噬细胞活化的指标，RAW264.7巨噬细胞分泌NO和细胞因子，可促进先天免疫，但是过度分泌NO和细胞因子则可能导致炎症。与空白对照组相比，4 种超滤分离组分均可以显著提高RAW264.7巨噬细胞的NO释放量，且与＞10、5～10 kDa和3～5 kDa 3 个组分相比，＜3 kDa的杏鲍菇多肽刺激细胞产生更高浓度的NO（（198.354±7.419）%），具有更强的免疫增强效果。研究表明，低分子质量肽具有更好的免疫调节效果，包括促进巨噬细胞增殖、细胞因子分泌等。此外，低分子质量多肽可能通过与TLRs等免疫细胞表面的受体直接结合，形成稳定的氢键，从而激活免疫细胞，增强免疫反应。细胞因子主要由巨噬细胞产生，可调节细胞生长、分化、功能和迁移，其主要类别包括白细胞介素、IFN和TNF。

如图1B所示，与其他组分相比，＜3 kDa的杏鲍菇多肽能够显著提高巨噬细胞IL-10、IL-1β、TNF-α、IFN-γ和iNOS的mRNA表达水平。这是由于低分子质量多肽可能通过影响巨噬细胞的极化状态来调节免疫反应，巨噬细胞可以根据激活状态不同而表现出不同的功能，其中M1型巨噬细胞倾向于促炎，而M2型巨噬细胞倾向于抗炎。以上结果初步表明，＜3 kDa的杏鲍菇多肽具有更高的免疫活性，可用于进一步的分离纯化。

2.2 凝胶层析分离组分的免疫活性

如图2A所示，＜3 kDa的杏鲍菇多肽组分经过Sephadex G-15进一步分离后，在吸光度220 nm处检测到两个分子质量＜1.5 kDa的吸收峰（Peak 1、Peak 2）。细胞活性实验结果（图2B）表明，杏鲍菇多肽Peak 1和Peak 2没有明显（P＞0.05）的生物毒性。与空白对照组相比，Sephadex G-15分离后的杏鲍菇多肽组分显著（P＜0.05）提高了RAW264.7细胞的NO释放量、细胞因子和iNOS的mRNA表达水平（图2C）。与杏鲍菇多肽Peak 1组分相比，杏鲍菇多肽Peak 2组分刺激后的RAW264.7巨噬细胞产生更高的NO释放率（（224.44±3.98）%），IL-1β、TNF-α和iNOS的mRNA表达水平也有明显提升。因此，确定杏鲍菇多肽Peak 2组分的免疫活性更高，用于下一步的RP-HPLC分离。分子质量是与免疫调节活性相关的重要参数之一。大多数免疫调节肽的分子质量小于2 kDa，如Yu Yihan等研究发现猴头菇肽经Sephadex G-15分离后的第2个馏分表现出最好的免疫调节生物活性；王越证明，经Sephadex G-15分离后，分子质量较小的花生肽（＜1 kDa）组分能促进巨噬细胞释放更多的NO，具有更强的免疫活性。此外，较小的分子质量使得多肽具有更好的溶解性，并能与酶活性位点有效协调，通过肠道屏障，并直接影响体循环中的免疫细胞。由此可见，分子质量较小的杏鲍菇多肽Peak 2组分具有更高的细胞免疫活性，可用于下一步分离纯化。

2.3 RP-HPLC分离组分的免疫活性

杏鲍菇多肽Peak 2进一步通过RP-HPLC分离获得了3 个峰（图3A，Peak 2-1、Peak 2-2、Peak 2-3）。与空白对照组相比，这3 个多肽组分对RAW264.7细胞的活性没有显著（P＞0.05）影响（图3B），说明在适当浓度范围内它们对细胞几乎没有毒性。与杏鲍菇多肽Peak 2-1和Peak 2-3相比，杏鲍菇多肽Peak 2-2能够显著（P＜0.05）提高巨噬细胞吞噬率、NO释放率以及IL-10、TNF-α和iNOS的mRNA表达水平（图3C）。该研究结果表明杏鲍菇多肽Peak 2-2具有更高的免疫调节活性。这是由于疏水性多肽中疏水性氨基酸（如缬氨酸、亮氨酸、脯氨酸等）的含量较高，能够增强与巨噬细胞膜的相互作用，同时避免因过强的疏水性导致的聚集或结合效率下降，从而更有利于免疫活性的发挥。这种相互作用可能有助于多肽被巨噬细胞上的受体识别，进而促进巨噬细胞的激活和免疫反应的启动。此外，疏水性多肽可能参与调节巨噬细胞的极化状态，影响其向M1型（促炎型）或M2型（抗炎型）的转变，这对于免疫反应的调节和组织修复非常重要。免疫激活通常依赖于多肽与细胞表面特定受体的结合，以启动下游信号通路。疏水性多肽容易在细胞膜表面聚集，难以有效穿透细胞膜进入细胞内部，从而削弱其与胞内靶点的结合效率；此外，强疏水性的多肽可能因与细胞表面受体的亲和力较低，难以诱导受体发生必要的构象变化，进而影响信号转导过程。因此，在本研究中，疏水性较高的Peak 2-3表现出较弱的免疫活性，而疏水性较低的Peak 2-2则显示出较强的免疫活性。为了进一步研究纯化后的杏鲍菇免疫活性肽Peak 2-2的一级结构，利用LC-MS/MS技术测定Peak 2-2所含的氨基酸序列。

2 杏鲍菇免疫活性肽的结构表征

利用LC-MS/MS对杏鲍菇免疫活性肽Peak 2-2进行de novo测序，根据可信度评分（≥99）、水溶性（良好）和毒性（无毒）筛选获得51 条多肽序列（表2）。这51 条多肽的长度在4～10 个氨基酸之间，肽的分子质量集中在1 000 Da以下，其羧基端的氨基酸大多是苯丙氨酸、组氨酸、亮氨酸、精氨酸和赖氨酸，氨基端的氨基酸大多是丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸。这是因为胰蛋白酶主要在赖氨酸和精氨的羧基端进行切割，因此这些氨基酸经常出现在由胰蛋白酶产生的多肽片段的羧基端。胃蛋白酶催化具有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸以及亮氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺等肽键的断裂，使大分子的蛋白质变为较小分子的多肽。因此，这些氨基酸也可能出现胃蛋白酶消化后的多肽片段的羧基端。

3 杏鲍菇免疫活性肽与TLR4-MD2蛋白的分子对接

TLR4-MD2复合体的激活与调节对于维持免疫平衡至关重要，它能够识别LPS，激活后通过髓样分化因子88（MyD88）依赖和非依赖机制传递细胞内信号，从而导致多种促炎细胞因子水平上调。利用薛定谔Schrodinger分子对接软件研究多肽与TLR4-MD2复合体的结合能力，以明确鉴定出的51 条多肽中免疫调节活性最强的肽段。如表2所示，DFPALR、SGFTLK、TLPALK、LLGVD、DFYNKP和TSLGELK的对接得分小于－6，分子力学-广义Born表面面积（MM-GBSA）计算的结合自由能小于－30 kcal/mol，其中DFPALR和LLGVD的对接得分和MM-GBSA结合自由能最低，图4为DFPALR和LLGVD的一级结构和二级质谱图。分子对接得分反映了配体和受体之间的能量匹配程度，包括范德华力、氢键、疏水作用等，得分越低意味着系统能量越低，结合越容易发生。MM-GBSA用于估算配体与受体结合时的自由能变化，是评估配体-受体相互作用稳定性的关键参数，负的结合自由能值意味着配体与受体结合后系统的自由能降低，即结合状态比未结合状态更稳定。如图5所示，DFPALR和LLGVD分别结合在TLR4-MD2复合体蛋白活性口袋表面。DFPALR与TLR4-MD2复合体蛋白的氨基酸残基（THR175、ASN205、NAG721、GLU254、HIS256）分别形成1 个氢键，与氨基酸残基GLU286形成1 个盐桥；LLGVD与TLR4-MD2复合体蛋白的氨基酸残基（ASP181、HIS159、ARG234）分别形成1 个氢键，与ARG289形成2 个盐桥、与ARG234和ASP181分别形成1 个盐桥。短肽与TLR4-MD2复合体的结合依赖于它们之间特定的相互作用，例如氢键和盐桥。这些相互作用维持了复合体的结构和功能，使其能够准确地识别和结合分子。在本研究中，多肽DFPALR和LLGVD都能够稳定地与TLR4-MD2结合，这表明它们在调节机体免疫反应方面可能发挥重要作用，从而促进免疫系统的调节功能。

4 分子动力学模拟

分子动力学模拟已被证明有助于指导实验验证过程，模拟研究有助于理解多肽与TLR4-MD2结合形成复合物后构象改变、稳定性波动和复杂系统的整体进展，它能够对关键参数进行全面评估。如图6A所示，DFPALR-TLR4-MD2复合物和LLGVD-TLR4-MD2复合物在模拟时间内的RMSD值的稳态变化范围小于1 nm，说明二者均形成了稳定的结合。如图6B所示，在整个模拟过程中，两个配合物的Rg值在20 ns后均保持稳定，LLGVD-TLR4-MD2复合物的Rg值低于DFPALR-TLR4-MD2复合物，表明LLGVD-TLR4-MD2复合物在MD模拟期间优于DFPALR-TLR4-MD2复合物的稳定性，这是因为分子间氢键对配合物的稳定性起着关键作用。

图6C显示了在MD模拟期间DFPALR-TLR4-MD2复合物和LLGVD-TLR4-MD2复合物的氢键数量变化情况，LLGVD-TLR4-MD2复合物的氢键数目高于DFPALRTLR4-MD2复合物的氢键数目，因此，LLGVD-TLR4-MD2复合物具有更好的结构稳定性。SASA表示配合物暴露在溶液中的表面积，SASA值越小，其暴露在溶液中的表面积越小，配合物的结构更紧密，更不容易产生热变性。如图6D所示，DFPALR-TLR4-MD2复合物和LLGVD-TLR4-MD2复合物的SASA值稳定在275 nm左右，说明两种复合物的结构紧密，结构不易发生改变。在MD模拟中，结合自由能的计算可以有助于预测配体与受体的结合强度，如图6E所示，DFPALR-TLR4-MD2复合物和LLGVD-TLR4-MD2复合物的总结合自由能变化均为负值，表示其结合为自发发生，多肽DFPALR和LLGVD在摄入体内后能够自发地与TLR4结合，从而激活下游信号通路，引起机体免疫反应。利用将氨基酸残基能量分解的方法计算各个氨基酸残基的能量贡献，可以更好地探究多肽与配体之间的相互作用，如图7所示，在DFPALR-TLR4-MD2复合物中有7 个氨基酸残基起主要的能量贡献作用，分别是THR175、LEU203、LEU204、ASN205、ARG227、GLU254和THR284。在LLGVDTLR4-MD2复合物中有6 个氨基酸残基起主要的能量贡献作用，分别是HIS159、ASP181、SER183、ARG234、PHE263和ARG289，其中ASP181和ARG289的能量小于－4 kcal/mol，说明这两个氨基酸在LLGVD-TLR4-MD2复合物的形过程中发挥着不可或缺的作用。

目前有大量研究通过不同食物来源肽的分子动力学模拟阐明了作用机制，这些肽表现出不同的生物活性，这些研究不仅揭示了肽在细胞信号传导、免疫调节和抗氧化等方面的作用，还为开发新型功能性食品和药物提供了重要的理论基础和实践指导。有研究表明，燕麦肽具有降血糖的功能，利用虚拟筛选技术筛得到6 个肽段，并对其进行分子动力学模拟，从模拟后稳定结合的构象分析多肽与二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase-4，DPP4）的互作信息，并计算其结合自由能，结果证明筛选出的多肽均能与DPP4稳定结合；Hanafiah等研究了各种抗菌肽与幽门螺杆菌蛋白的分子相互作用，分子动力学模拟结果显示多肽EcAMP1与I型幽门螺杆菌蛋白通过稳定的相互作用结合，结构没有明显的变化，表明EcAMP1可能可用作幽门螺杆菌治疗的潜在治疗剂。在本研究中，对DFPALR-TLR4-MD2复合物和LLGVD-TLR4-MD2复合物进行了分子动力学模拟，以比较其在结构和动态行为方面的相互作用。根据RMSD、Rg和氢键数目等指标检验分子的稳定性，从各项指标的结果来看，多肽DFPALR和LLGVD与TLR4-MD2结合均是自发的，其结合生成的复合物在模拟过程中都是稳定的，这表明多肽DFPALR和LLGVD作为新的免疫活性肽具有很大的潜力，可以有效提高机体的免疫力。

结论

本研究验证了杏鲍菇蛋白酶解液超滤组分的免疫活性，其中＜3 kDa的组分免疫活性最高，能够显著提高RAW264.7巨噬细胞吞噬率，促进NO释放，并能显著提高细胞因子尤其是IL-1β、TNF-α和iNOS的mRNA表达水平。进一步经Sephadex G-15葡聚糖凝胶柱层析和高效液相分离获得具有更强免疫调节活性的杏鲍菇多肽组分Peak 2-2。对筛选出的多肽进行了结构表征和分子对接，确定DFPALR和LLGVD与TLR4蛋白的活性口袋结合稳定，并通过分子动力学模拟进一步验证了两条多肽序列与TLR4-MD2蛋白结合的可自发性，表明多肽DFPALR和LLGVD具有良好的免疫调节活性。本研究可为杏鲍菇免疫活性肽的开发和利用提供理论依据，未来将进一步探究其作用机制。

作者简介

通信作者：

赵立艳 教授

南京农业大学食品科技学院

2006年毕业于中国农业大学食品科学与营养工程学院，获博士学位，美国康奈尔大学和罗格斯大学访问学者（2013-2015）。江苏省现代农业（特粮特经）产业技术体系岗位专家，江苏省六大高峰人才，2023年获得江苏省农学会女科学家奖和南京农业大学优秀共产党员称号，2022年度获得南京农业大学优秀教师称号，2020年度获得南京农业大学优秀研究生教师称号。兼任中国食用菌协会香菇分会副理事长，中国食品科学技术学会果蔬加工技术分会理事长，江苏省食品安全风险评估专家委员会委员，江苏省冷链学会预制菜专业委员会常务委员。近年来主持国家自然科学基金面上项目2 项，国家十四五、十三五重点研发计划课题1 项、子课题3 项，江苏省自主创新项目1 项，江苏省产业技术体系（特粮特经）贮藏加工创新团队等多项国家、省部级科研项目，作为主要完成人获江苏省科学技术一等奖2 项。发表论文100余篇，其中SCI论文60余篇，获得授权专利10余项。

第一作者：

田江榕 硕士研究生

南京农业大学食品科技学院

主要研究方向：食用菌多肽的免疫功能及吸收特性。

本文《 杏鲍菇多肽的分离纯化、结构表征及免疫活性》来源于《食品科学》2025年46卷第11期94-104页，作者： 田江榕，仲磊，纪阳，胡秋辉，赵立艳*。DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20241204-028. http://www.spkx.net.cn。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑：申婧婧；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。

图片来源于文章原文及摄图网。

为了帮助食品及生物学科科技人员掌握英文科技论文的撰写技巧、提高SCI期刊收录的命中率，综合提升我国食品及生物学科科技人员的高质量科技论文写作能力。《食品科学》编辑部拟定于2025年8月7-8日在 中国 湖南 长沙 举办“第12届食品与生物学科高水平SCI论文撰写与投稿技巧研修班”，为期两天。

长按或微信扫码了解详情

为贯彻落实《中共中央国务院关于全面推进美丽中国建设的意见》《关于建设美丽中国先行区的实施意见》和“健康中国2030”国家战略，全面加强农业农村生态环境保护，推进美丽乡村建设，加快农产品加工与储运产业发展，实现食品产业在生产方式、技术创新、环境保护等方面的全面升级。由中国工程院主办，中国工程院环境与轻纺工程学部、北京食品科学研究院、湖南省农业科学院、岳麓山工业创新中心、中国工程科技发展战略湖南研究院承办，国际食品科技联盟（IUFoST）、国际谷物科技协会（ICC）、湖南省食品科学技术学会、洞庭实验室、湖南省农产品加工与质量安全研究所、中国食品杂志社、中国工程院Engineering编辑部、湖南大学、湖南农业大学、中南林业科技大学、长沙理工大学、湘潭大学、湖南中医药大学、新疆维吾尔自治区农业科学院协办的“2025年中国工程院工程科技学术研讨会—推进美丽乡村建设-加快农产品加工与储运产业发展暨第十二届食品科学国际年会”，将于2025年8月8-10日在中国 湖南 长沙召开。

长按或微信扫码进行注册

为进一步促进动物源食品科学理论的完善与创新，加速科研成果向实际生产力的转化，助力产业实现高质量、可持续发展，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、中国食品杂志社将与江西农业大学、江西科技师范大学、南昌师范学院、家禽遗传改良江西省重点实验室共同举办的“2025年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”，将于2025年10月25-26日在中国 江西 南昌召开。

长按或微信扫码进行注册

北京食品科学研究院、中国食品杂志社和全国糖酒会组委会将于2025年10月16-18日在江苏省南京市南京国际博览中心举办第113 届全国糖酒会食品科技成果交流会。食品科技成果交流会期间举办食品科技成果展，本届科技成果展以我国当前食品产业科技需求为导向，重点邀请“十四五”以来获得国家和省部级重要科研项目支持产出的食品科技新成果、新技术、新产品参展，并针对企业技术需要开展精准对接服务。

长按或微信扫码进行注册