Science丨David Baker团队开发从头设计内在无序蛋白区的通用蛋白设计框架

传统蛋白质设计多基于稳定的三维结构，我们习惯将蛋白功能与三维结构绑定在一起。但越来越多研究表明，约 40% 的人类蛋白质功能域为内在无序区域（ IDRs ）或内在无序蛋白（ IDPs ） —— 这些区域缺乏稳定结构、序列高度可变，使得它们成为药物设计和功能解析中的 “ 黑洞 ” 。然而，它们广泛参与：信号转导、转录调控 ； 疾病蛋白聚集（如 tau 、 alpha-synuclein ） 以及 蛋白相互作用与蛋白降解 。 尽管自然界已进化出抗体、 MHC 分子、重复结构蛋白等多种机制识别特定蛋白无序序列， IDR 结构多样未知、序列高度冗余，严重限制了抗体、小分子及经典蛋白设计方法的应用。因此长期以来被视为 “ 不可成药 ” 的靶点区域。

近日，华盛顿大学蛋白设计研究所（ Institute for Protein Design ）所长David Baker团队在 Science 发表了题为

Design of intrinsically disordered region binding proteins

核心设计流程 包括： 1 ） 构建模板蛋白库：设计出约 1000 种蛋白骨架，这些骨架 “ 包裹 ” 住任意无序肽段的主链（其中肽段以非经典二级结构构象存在），并专门针对极性氨基酸构建出高保真度的氢键网络和疏水识别口袋。 2 ） 拼接识别口袋：利用深度学习算法将不同识别口袋随机组合成可以识别任意序列短肽的新蛋白架构（ 8-40 AA) 。该库一旦生成，可供非专业设计人员重复回收使用。 3 ） 序列筛选与匹配：将待识别目标（如 full IDP 、短肽、 GPCR 尾段等）片段 “ 穿线 ” 进模板库，打分寻找最优绑定构象和 靶向 窗口。 4 ） 局部构象调整及侧链口袋优化：固定住由氢键网络支撑起的肽链构象和核心作用位点 (motifs) ，采用 RFdiffusion 重组和优化所有剩余界面以进一步增强对每一靶标的侧链识别特异性。通过迭代结构预测与优化 ( ProteinMPNN - AF2 iterations) 生成最终设计。 5 ） 结合实验验证：利用 BLI 、 nanoBiT 、 FP 测试，验证设计蛋白对每一设计靶标的结合亲和力和特异性（ 39/43 靶标一次获得结合蛋白； 34/39 靶标未经优化 Kd < 100nM ；最低 Kd < 100pM ）。

团队 成功设计出可结合 39 个高度不同目标的结合蛋白（包括疾病相关 IDRs 、 GPCR 配体、癌症融合蛋白等），其中 34 个目标的设计未经任何优化体外 Kd 达到 pM 到 100 nM 级别。平均每个靶标实验测试 22 个 设计。高极性序列也能被精准识别（如 EWS/FLI 、 CSP-N ），平均每 10 个氨基酸段内可形成 >10 个氢键（包含大量侧链氢键用以提升序列特异性）。 团队还 成功解析设计蛋白与目标肽段（如 dynorphin ）的晶体结构（ 3.15 Å ）与 NMR 谱，证实结合界面预测准确，且设计结合蛋白成功诱导无序靶标采用全新、自然界未知的构象结合（ “induced fit”) 。

该方法不仅具有普适识别能力，还直接展示了五类生物医学和技术应用潜力：

1. 蛋白组富集低丰度复合物（ Enrichment & Interactome ）

可应用于探索功能未知的 IDR 复合体在信号通路中的作用，或富集超低丰度调控蛋白。

· 设计蛋白 FAM21_1b1 可从细胞裂解液中 结合 参与调控人体信号通路的整套 WASH 复合物（ WASHC1–5 ），显示其能识别 IDR 驱动的蛋白互作网络；

· 设计蛋白 PER2_1b1 可 钓出 调控昼夜节律的重要蛋白 PER2 ，证明其在相分离调控蛋白识别中的潜力。

2. 病变肽段富集（ Peptide Capture for Proteomics ）

为靶向变性蛋白片段、突变肽段检测提供新工具，适用于疾病 早筛与蛋白质 组学富集。

· 设计蛋白 CTN4_1b1 针对一种 12aa 的突变肽段（来自新生儿溶酶体疾病相关蛋白 cystinosin ）；

· 用磁 珠结合 CTN4_1b1 后，与血液样本孵育，仅用 LC-MS 即可检测到极低浓度目标肽；

· 在缓冲液和血样中回收率高达 90% ，优于之前发表的 高结合 力 α 螺旋结合蛋白在相似应用中的表现。

3. 癌细胞表面特异识别（ Targeted Cell Recognition ）

可作为新型肿瘤靶向工具，构建诊断 / 治疗融合蛋白。

· Mesothelin （ MSLN ）是一种在多种癌症中上调的膜蛋白。传统抗体难以识别 其近膜区域 ， 而近膜无序 区域受人体蛋白酶剪切造成受体脱落，因而靶向失效；

· GFP-fusion 设计蛋白 MSLN_1b1 特异性结合表达 MSLN 的 HPAC 细胞，但不结合阴性 MCF7 细胞；

· 结合蛋白具有特异性定位未剪切癌细胞受体，或阻断蛋白酶剪切的潜力。

4. 拮抗神经肽信号通路（ GPCR antagnosim ）

可延展至设计 GPCR 调控剂的新思路（通过结合多肽激动剂或 GPCR 胞外无序区间）。

· 神经肽 Dynorphin A 可激活 KOR （ kappa opioid receptor ），与慢性疼痛等病理有关；

· 设计蛋白 DYNA_2b2 在体外 cAMP 抑制实验中，成功抑制 KOR 信号通路， IC₅₀ = 50nM ；

· 该设计去除 YGGF 启动子序列，具备良好特异性与调控能力。

5. 细胞内外靶向验证与结合特异性测试（ In-Cell/in-vitro Orthogonality ）

为细胞内调控工具与模块化合成元件设计提供可验证机制。

· 将 6 种设计蛋白与 sfGFP 融合，靶标肽段与 mCherry 融合，定位于线粒体外膜；

· 所有 “on-target” 组合显示 GFP 共定位，所有 “off-target” 组合无结合；

· 针对 20 个目标的全交叉体外 BLI 测定也验证了绑定专一性（被测组均为 Kd < 100 nM ，极低交叉反应）。

这项研究突破了传统蛋白质设计的结构限制，实现了对结构高度无序、功能复杂的蛋白区域的精准识别。相比天然抗体或现有识别蛋白，该平台具备：高精度，高成功率设计：无需免疫动物或高通量筛选；适配性广泛：普适性针对由易到难的各种疏水 / 亲水 / 带电序列；结构多样性与适应性强：结合目标采用随机卷曲、部分螺旋或部分 β 链 的多种灵活构象，对所有 20 种氨基酸普遍友好。

该技术为开发新一代识别、调控、降解内在无序蛋白提供了通用策略，具有广泛的应用前景：疾病检测与诊断（如癌症融合蛋白、神经肽等） ； 细胞内信号调控与合成生物学工具 ； 神经退行性疾病的 早筛与治疗 ； 全新药物靶点开发（尤其是传统 “ 不可成药 ” 的蛋白区域） 。

https://www.science.org/doi/10.1126/science.adr8063