实验室必看！斜面/液体/半固体接种规范与技巧

一、斜面接种

1）在肉膏蛋白胨斜面试管上，用记号笔写上将接种的菌名、日期和接种者。

2）点燃酒精灯或煤气灯。

3）将菌种试管和待接种的斜面试管，用大拇指和食指、中指、无名指握在左手中，并将中指夹在两试管之间，使斜面向上，成水平状态，在火焰边用右手松动试管塞，以利于接种时拔出。

4）右手拿接种环通过火焰烧灼灭菌，在火焰边用右手的手掌边缘和小指，小指和无名指分别夹持棉塞（或试管帽），将其取出，并迅速烧灼管口。

5）将灭菌的接种环伸入菌种试管内，先将环接触试管内壁或未长菌的培养基，达到冷却的目的，然后再挑取少许菌苔。将接种环退出菌种试管，迅速伸入待接种的斜面试管，用环在斜面上自试管底部向上端轻轻地划直线，勿将培养基划破，也不要使环接触管壁或管口。

6）接种环退出斜面试管，再用火焰烧管口，并在火焰边将试管塞塞上。将接种环逐渐接近火焰，再烧灼。如果接种环上沾的菌体较多时，应先将环在火焰边烤干，然后烧灼，以免未烧死的菌种飞溅出污染环境，接种病原菌时更要注意此点。

二、液体培养基接种

液体培养基接种是用接种环、移液器或吸管等工具，将菌体或菌液移至试管、三角瓶等容器中的液体培养基中的一种接种方法。其操作与前面斜面接种基本相同，但应注意：液体培养基试管管口或三角瓶瓶口略向上以免培养液流出；加入菌体时，应使接种环与管内壁轻轻研磨，使菌体擦下，塞好棉塞后，将试管在手掌心中轻轻敲打或轻轻摇晃三角瓶，使菌体混合均匀。

1、试管液体接种

试管液体接种是将一定体积的样品混悬液加入到盛有指定液体培养基的试管内，或将一定体积、按标准规定条件下培养过的培养液接入盛有指定液体培养基的试管内（有时是指接种环取一环，或移液管移液器移取一定的体积，例如0.1mL、1mL等）。涉及试管液体接种的操作有MPN法检测大肠菌群/大肠杆菌，以及沙门氏菌、单增李斯特氏菌的二次增菌转接操作等。

此处以用移液器将一定体积的样品混悬液接入到盛有指定液体培养基的试管内为例，具体操作如图。

① 用酒精棉消毒操作台面。将移液器吸头盒放入酒精灯右侧，靠近酒精灯放置。将需要进行液体转接的试管插在试管架上，置于酒精灯左边左手附近。将移液器调至合适的刻度放于右手附近的架子上。废物缸放于右手能触及的范围内。

② 点燃酒精灯，左手于酒精灯火焰附近打开移液器吸头盒，右手持移液器用力插取吸头两下以防吸头松动脱落，拔出移液器并盖上移液器吸头盒盒盖。左手取待转接液体试管，试管底部位于左手手心，移液器吸头和试管口应在酒精灯火焰周围的无菌区域之内。

③ 将试管伸向右手。右手食指，中指，无名指握住移液器，拇指靠在移液器按钮上，小指和掌心下缘合围夹住试管帽并用力拔出。如果操作者的手比较小，可以靠食指无名指和小指握住移液器，拇指仍靠在液体按钮上。而中指向外伸，靠中指内侧和食指、无名指外侧夹住试管帽。将试管口和移液器吸头靠近火焰，试管口灼烧一周，在火焰附近将吸头刚好伸入试管口，抵住试管内壁下侧，同时按住移液器按钮至一档（轻微推不动）。不要将移液器吸头伸到试管底部，而应倾斜试管使液面倾斜至试管口附近并没过吸头尖端。右手拇指缓慢松开，使液体缓缓吸入洗头，注意不要吸入空气。如果有空气吸入，必须将液体压回试管重新吸取。当右手拇指完全松开时，撤离移液器，注意吸头需尽量一直围绕在在酒精灯火焰附近，并且吸头务必保持向下姿势以防止液体倒流入移液器内部引起污染。

④ 吸完液体后，将移液器撤离试管，移液器吸头移到酒精灯火焰的远离操作者的一侧，将试管口在火焰上灼烧灭菌。

⑤ 灭菌后，右手小指迅速将试管帽盖上，此时移液器吸头仍然要在火焰形成的无菌区域内，不可离酒精灯火焰太远。盖上试管帽将试管归位。

⑥ 左手取待转接入液体的试管，右手保持移液器吸头在酒精灯火焰附近。

⑦ 右手保持握移液器姿势取下试管帽并灼烧管口。将吸头抵靠在试管口的内壁上，缓缓推动移液器按钮至底（完全推至第二档，使残存在吸头尖端的液体也流出）。推出液体时注意不要将吸头深入试管底部，也不要用力推导致液体飞溅。

⑧ 左手将试管口靠近火焰灭菌，移液器吸头移到酒精灯火焰的另一侧。再次灼烧试管口

⑨ 右手保持握移液器姿势将试管帽盖上，将试管归位。移取液体完毕后，按压移液器滑动杆使吸头脱落至废物缸，移液器放回架子。熄灭酒精灯，将台面消毒并收拾干净。

2、三角瓶液体接种

相对于试管的液体接种培养，三角瓶接种培养的优势在于通气效果好。多见于霉菌或一些细菌的复壮培养或者摇床培养等。操作与前面提到的液体试管接种操作基本相同，最后将液体加入三角瓶的时候，三角瓶倾斜，移液器吸头抵在三角瓶的内壁，缓缓将液体加入，避免喷溅和气泡，见下图。

向肉膏蛋白胨液体培养基中接种少量菌体时，其操作步骤基本与斜面接种时相同，不同之处是挑取菌体的接种环放入液体培养基后，应在液体表面处的管内壁上轻轻磨擦，使菌体从环上脱落，混进液体培养基，塞好试管塞后，摇动液体，使菌体在液体中分布均匀，或用试管振荡器混匀。

向液体培养基中接种量大或要求定量接种时，可将无菌水或液体培养基注入菌种试管，用接种环将菌苔刮下，再将菌种悬液以无菌吸管定量吸出加入，或直接倒入液体培养基。如果菌种为液体培养物，则可用无菌吸管定量吸出加入或直接倒入液体培养基。整个接种过程都要求无菌操作。

三、半固体培养基穿刺接种

用接种针挑取菌种（针必须挺直），自培养基的中心垂直地刺入半固体培养基中，直至接近管底，但不要穿透，然后沿原穿刺线将针拔出，塞上试管塞，烧灼接种针。

1、水平法：左手将试管水平放置，右手拿接种针，将接种针水平穿入培养基中。

水平穿刺操作

2、倒立法：右手将接种针竖直放置，左手将带有培养基的试管倒立后，接种针穿入培养基中，见下图。

倒立法穿刺操作

上述几种接种法的无菌操作，凡未叙述的均按实验一操作。试验者应反复练习无菌操作接种技术，直至较熟练地掌握。

四、将已接种的斜面、液体和半固体培养基放置28—30℃温箱，培养2—3天后取出观察结果。

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