类器官养出心魔了：长势慢、成球难、毕业慢（送类器官资料包）

类器官研究火到发烫，导师一句「跟上热点」把我推上不归路！现在别说顶刊梦，能不能按时毕业都成谜！

师姐，我收了半个月的肿瘤样本，提的细胞养了一周才勉强成球，结果过夜就解体了。

师姐

大概率是细胞活力和接种密度没把控好。类器官培养得挑活力 > 90% 的细胞，而且不同肿瘤细胞的成球密度差很多。

细胞密度我是按照你们笔记来的呀！

师姐

那是肝癌细胞的经验！你养的乳腺癌细胞得重新优化参数。成球速度慢还可能和基质胶浓度、培养基添加物有关，我这里有一些类器官培养资料，发给你好好学习一下吧！（点此免费领取类器官资料包）

为助力科研工作者攻克类器官实验难题，我们重磅推出《类器官培养及分析实战资料包》！涵盖各种类器官（如脑、肾、肝、肺、乳腺等）的形成机制、培养方法，从基础细胞培养、疾病模型构建到下游分析的全链条操作指南，实验步骤拆解详尽，并对关键质控点做重点标注。

资料包附赠 2 场类器官研讨会高清录播，既能帮你攻克类器官构建难题，详解表征分析、药筛设计等硬核方案；也能带你吃透免疫化类器官进展、3D 模型构建、高通量测序等知识，直击前沿技术核心！如果您也遇到类器官形态异常难以传代、分化诱导效率低无法构建模型、细胞增殖缓慢难以满足下游分析需求等难题，这套资料包正是破局关键！

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资料包亮点抢先看

Part 1 类器官的培养方案

包埋培养与扩增：小细胞簇和/或肿瘤类器官形成后，将其收集并重铺于基底基质提取物（BME，Geltrex Flex 基质胶）圆顶中，进行包埋培养下的初始扩增（通常传代 2～4 次），直至获得稳定的增殖速率；在建立新的肿瘤类器官系时，初始几次传代过程中活细胞数量常会出现下降。成功建系后，肿瘤类器官开始以相对稳定的倍增时间进行扩增，此时可过渡至悬浮培养以便于大规模扩增。包埋培养的更多细节请参阅相关实验手册。

悬浮培养扩增：一旦获得稳定的细胞增殖，建议采用悬浮培养进行大规模扩增以建立细胞库。在过渡至悬浮培养前，建议先冻存至少两管取自包埋培养的细胞（每管 ≥ 2 × 10⁶ 个活细胞），随后将 ≥ 2.5 × 10⁵ 个活细胞铺板至悬浮培养体系（相当于 2.6 × 10⁴ 个活细胞/cm2）。将包埋培养体系过渡至悬浮培养的更多细节请参阅实验手册。

从包埋培养到悬浮扩增，类器官的稳定增殖只是研究的第一步。想要真正解锁其在肿瘤生物学和药物筛选中的应用潜力，基因编辑和转染技术的选择尤为关键——错误的改造方法可能导致类器官异质性丧失，甚至完全偏离原始肿瘤特征。

Part 2 肿瘤类器官改造及转染痛点全解析

将肿瘤类器官改造为过表达或下调特定基因，更好地了解癌症生物学，或评估某些药物对肿瘤细胞的作用。建议采用转导方法以获得稳定的细胞库，可保留亲代肿瘤类器官群体的遗传和转录组学特征。不建议在通过电转染或脂质体转染递送有效负荷后进行克隆选择，因为克隆扩增和/或低转染效率可能导致肿瘤类器官群体的异质性丧失，具体对比数据可见下表。

➤ 传染常见痛点及解决方案

更多肿瘤类器官基因改造操作要点可在手册中查看（点此免费领取类器官资料包）

Part 3 如何利用肿瘤类器官轻松完成药物筛选

肿瘤类器官模型用于药物筛选，常受限于培养基不好用、模型适用范围窄、扩增难等问题。好在 Gibco™ OncoPro™ 肿瘤类器官培养基能针对性解决这些痛点，让药物筛选更轻松。下面以结直肠癌类器官为例，为大家介绍药物筛选流程：

第 1 步：使用 OncoPro 肿瘤类器官培养基悬浮培养细胞，进行扩增。若要接种一个完整的 96 孔板，需要大约 1.5 X 106 个解离的肿瘤类器官。

第 2 步：在平底 96 孔板的每孔 100 μL 培养基中接种10,000～15,000 个解离的肿瘤类器官，以保持接种量一致，稳健形成肿瘤类器官。后续保持培养 72 h。

第 3 步：将化合物以 2X 浓度添加到 100 L 含有 BME 的 OncoPro 培养基中，至 96 孔板中每孔的最终体积为 200 L，每孔中的最终药物浓度为 1X。所有筛选分析中均应包含适当的阳性和阴性对照。

第 4 步：在第 6 天添加 PrestoBlue HS 细胞活力试剂，并在第 7 天读取信号，获得结果。

更多药物筛选方案及操作要点可在手册中查看（点此免费领取类器官资料包）

新手刚接触 3D 细胞培养，总担心类器官太难 hold 住？别慌！可以先从入门级的球状体培养入手。不用复杂设备，跟着手册走，3 步就能建起 3D 肿瘤细胞模型～

Part 4 新手必看的 3D 肿瘤细胞模型构建速成攻略

第 1 步：选择正确的培养基进行细胞系培养

3D 细胞培养所用的基本培养基与 2D 细胞培养中所用的相同。一般而言，基础培养基通常会补充血清，并额外添加特定生长因子、细胞因子和激素。

第 2 步：使用 Nunclon 形成均匀的细胞球状体

✔ 在细胞达到分裂融合度后，使用细胞解离试剂（如 TrypLE 试剂）将单层细胞从细胞培养表面剥离，制成单细胞悬液，并检测细胞浓度和活性。根据细胞接种密度，在完全培养基中稀释所需数量的细胞，然后接种到 Nunclon Sphera 超低附着培养板上。

✔ 离心后将培养板置于 37 °C，5% CO2 的培养箱中静置培养。球状体生长时，使用新鲜培养基更换原培养基，使原培养基与新鲜培养基的比例为 1:1，并以固定时间间隔置培养基换直到球状体准备就绪。

第 3 步：针对具体细胞类型优化生长条件

✔ 有些细胞类型可以很容易地形成球状体，而有些细胞类型的球状体形成条件则非常苛刻。对于后者，需要对培养基或细胞接种条件进行一系列优化以促进球状体形成。

✔ 通常，具有圆形形态并成簇生长的细胞易于形成球状体。而长形且不成簇生长的细胞需要额外的培养基添加剂才能形成球状体。

第 4 步：检查球状体大小、紧密度、细胞健康状况和活性

使细胞在悬浮条件下生长以形成球状体会让它们承受较大压力。因此，在将球状体用于下游测定之前，评估细胞的健康状况和活性非常重要。通常使用直径 300～500 μm 的肿瘤细胞球进行药物反应测定。借助成像和酶标仪评估细胞活性和健康状况。

第 5 步：测量化疗药物的剂量反应

✔ 在完成对细胞健康状况和球状体活性的评估之后，即可将健康的球状体用于各种下游测定。

✔ 包括但不限于：细胞毒性检测、细胞凋亡检测、细胞增殖经检测，以及评价药物治疗对基因和蛋白质表达的影响的检测。

具体实验细节及注意事项可在手册中获取。

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内容策划：王丹琦

内容审核：吴军

题图来源：图虫创意