JACS丨娄智勇/刘冬生合作破解冠状病毒抵御核苷类抗病毒药物的核心机制

冠状病毒（ CoV ） 拥有 当前已知RNA病毒中 最大最复杂的基因组 ， 可以 通过独特的校对机制维持其 巨大 基因组的保真 性 。这一机制依赖非结构蛋白nsp14的外切核酸酶（ ExoN ）结构域 。 ExoN 可切除 在新生RNA链3 ’ 末端掺入的错配核苷酸，从而降低复制过程中出现错误的概率。 作为 一类重要的抗病毒小分子 化合物 ， 核苷酸类似物可以被RNA聚合酶识别并掺入新生RNA链中，从而终止RNA延伸或提高基因组的突变率。目前，FD A批准的三种治疗新冠病毒的小分子药物中有两种都是核苷类似物 ，包括 瑞德西韦和莫努匹韦。然而，冠状病毒的 校正机制 可能 会 将掺入RNA 链 中的 核苷酸类似物 切除， 从而 使得本可发挥作用的 抗病毒 核苷类似物“功亏一篑” 。因此，解析 ExoN 识别并切除 核苷酸类似物 的分子机制 ，对于 设计能逃逸 冠状病毒 校对 机制 的 核苷酸类似物 具有重要意义。

近日，清华大学基础医学院、 教育部蛋白质科学重点实验室娄智勇教授 团队 及香港理工大学刘冬生教授团队在 Journal of the American Chemical Society 发表了题为Structural basis and rational design of nucleotide analogue inhibitor evading the SARS-CoV-2 proofreading enzyme的研究论文，该研究评估了冠状病毒nsp10/14复合体对不同核苷酸类似物的切割效率，并利用冷冻电镜解析了新冠病毒nsp10/14:RNA-SMP复合体及nsp10/14:RNA-ATMP复合体结构。此外，该研究提出了冠状病毒ExoN识别核苷酸类似物的分子模型及ExoN对核苷酸类似物切割活性的评估策略，为开发可以逃逸ExoN的核苷酸类似物提供了支持。

研究人员 首先利用化学合成将多种核苷酸类似物 分别 掺入RNA的3 ’ 末端，然后评估了新冠病毒nsp10/14复合体对 不同 RNA底物的 水解效率。结果显示nsp10/14对3 ’ 末端掺入索菲布韦单磷酸（SMP）的RNA水解效率显著低于其他RNA底物。值得注意的是，尽管AT-527和SMP在核糖上具有相同的 2 ’ -F/Me 修饰，然而其抵御 ExoN 水解的能力差异明显。 为了阐明其潜在的原因 ，研究 人员 分别 解析了nsp10/14 :RNA-SMP 及 nsp10/14:RNA-ATMP 复合体 的 结构 。 结果显示 ，相比于天然核苷酸，SMP 核糖上的2 ’ -F/Me削弱了其与nsp10/14 之间 的 相互作用，这导致SMP无法稳定结合在 ExoN 的活性中心 。 反之，在nsp10/14:RNA-ATMP复合体中， ExoN 与ATMP的鸟嘌呤碱基之间的相互作用大大弥补了这些相互作用的缺失，使得ATMP 可以 稳定结合在活性中心， 并 更容易受到催化水的亲核攻击。 通常， ExoN 的活性中心可以招募一个水分子，并在 “DEDDH“催化残基 及二价金属离子的作用下稳定在磷酸二酯键附近，用来亲核攻击磷酸二酯键从而造成断键。然而，在nsp10/14:RNA-SMP复合体中， 研究人员没有在nsp10/14:RNA-SMP复合体的 ExoN 催化中心观察到催化水的密度，说明 水分子无法 稳定结合在催化中心来破坏SMP上的磷酸二酯键。这也与前面酶活动力学检测观察到的结果相一致。 值得注意的是， 研究人员 在nsp10/14:RNA-ATMP复合体 的 ExoN 活性口袋 中 观察到了三个水分子的密度，并根据其功能不同，将其分别定义为辅助水（a-H 2 O）、桥接水（b-H 2 O）和催化水（c-H 2 O）。这三个水分子在介导 ExoN 对ATMP的水解中发挥十分关键的作用。

通过结构比较，研究人员发现H 95 、Q145和F146与核苷酸类似物之间的相互作用可能影响 ExoN 的水解效率。因此， 研究人员分别将H 95 、Q145和F146突变为丙氨酸，并检测了nsp10/14突变体对RNA-ATMP底物的反应效率。结果显示，相比于野生型蛋白，nsp10/14突变体对底物的反应效率均显著下降。为了排除核糖修饰可能对 蛋白 酶活带来的影响， 研究人员还评估了nsp10/14突变体对 天然 RNA底物的水解效率，其结果 与RNA-ATMP底物一致。

随后，研究人员 将结构生物学与分子动力学模拟相结合， 开发了一种基于结构的 活性 评估系统 。 这种方法通过 计算在正确位置检测催化水存在的概率 ，来评价nsp14 ExoN 对掺入RNA链的核苷酸类似物的水解活性。根据突变实验和结构分析，研究人员确定E92为 磷酸二酯键裂解过程中 用于 稳定催化水的主要 氨基酸 残基。 当催化 水位于目标磷酸盐原子和 E92的羧基附近，同时与目标磷酸盐及其邻近核苷酸的O3'对齐，则被 认为 可以进行 亲核攻击。 研究人员对不同系统分别进行了 100 ns的 分子动力学 模拟， 并选取了 最后50 ns的轨迹用于分析。结果表明，催化水存在的概率在不同的系统中是不同的，其中 在 nsp10/14: RNA-SMP系统 中存在 的概率明显低于其他系统。这一观察结果与生化结果一致，即RNA-SMP底物抵抗 ExoN 水解 的能力明显高于 其他底物。 此外，研究人员还 改变了催化水的检测 阈值，并发现 在不同 阈值 下， 不同 系统中催化水 存在 的可能性保持一致， 说明该方法具有一定 的 稳定 性。 综合以上结果，研究人员提出了冠状病毒nsp14 ExoN 反应的“拉-切“模型： 当 RNA链3 ’ 端 的核苷酸类似物 到达nsp14 ExoN 的活性位点时，如果它们的碱基部分与H95/Q145/F146形成充分的相互作用， 则会 导致核苷酸 类似物呈现”舒展“的 构象，这有利于 催化水攻击磷酸二酯键 。在这种情况下，核糖 上 2 ’ -F/Me修饰不会影响nsp14 ExoN 募集水分子进行 亲核攻击 。相反，如果 核苷酸类似物 的碱基部分不能与H95/Q145/F146形成充分的相互作用， 则会使 核苷酸 类似物 处于“ 蜷缩 ”的构象。在 这种 构象中，2 ’- F/Me修饰可能阻止了 ExoN 对 催化 水 的募集，从而减弱了nsp14 ExoN 的 水解效率。

在此基础上， 研究人员 提出 ， 能够 逃逸 nsp14 ExoN 水解 的 核苷酸类似物必须具有 ：(1)一个不与H95/Q145/F146相互作用的碱基；(2)核糖上有适当的化学修饰（如2 ’ -F/Me）。基于这一原理， 研究人员设计了两种可能逃逸nsp14 ExoN 水解的核苷酸类似物。这两种核苷酸类似物保留了核糖上2 ’ -F/Me修饰，仅对碱基部分进行改造。其中compound 1 采用了腺嘌呤碱基，compound 2采用了脱氧尿嘧啶碱基。通过分子动力学模拟和酶活动力学检测，研究人员发现这两种核苷酸类似物均可以有效抵御nsp14 ExoN 水解，且效果比SMP更佳。值得注意的是，这两种核苷酸类似物还可以终止RNA聚合酶的延伸反应，说明其具有抑制冠状病毒 在细胞内增殖 的潜力。

总的来说，这项研究通过将酶活动力学检测、结构生物学与分子动力学模拟相结合，解析了冠状病毒 ExoN 识别并切除核苷酸类似物的机制，并提出了设计可能逃逸 ExoN 水解的核苷酸类似物的基本原理。此外，该研究还 建立了一种全新的评估系统，即 通过计算催化水在正确位置出现的概率 来预测 ExoN 对核苷酸类似物的水解能力，为在未来应对 冠状病毒带来的挑战提供了必要的工具。

清华 大学 娄智勇 教授 和 香港理工大学刘冬生 教授 为本文的共同通讯作者， 清华大学 博士研究生 王俊博 、 潘玙璠和刘奕 潇 为本文的共同第一作者。

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.5c05014

制版人：十一

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