《食品科学》：齐鲁理工学院刘英杰副教授等：微生物合成酪氨酸衍生物的代谢途径调控策略研究进展

酪氨酸作为一种重要的前体，可以通过不同的酶促反应合成多种酪氨酸衍生物。由于植物生长周期长、提取率低等限制因素，酪氨酸高值衍生物的其他合成方式逐渐被开发，利用代谢工程改造微生物从头合成酪氨酸高值化合物是一种潜力化的生产方式，该方式不仅绿色环保，而且成本低廉。

为提高微生物细胞工厂的生产力，需要对微生物中终端产物的代谢途径进行调控。由于代谢系统的复杂性，新兴调控技术和策略开始出现。相比于传统的代谢调控策略，基因组规模代谢模型（GEMs）、生物传感器等新型的技术与其相结合可以更精准高效调控代谢网络，进而提升终端产物的生产效率和合成通量。

齐鲁理工学院生物与化学工程学院的周丹丹、马营、刘英杰*介绍酪氨酸衍生物的生物合成路径，并综述微生物细胞工厂中酪氨酸衍生物合成途径的调控策略，包括常规的模块化工程策略和新兴技术。对于模块化工程策略部分，本文将酪氨酸衍生物合成途径分为4 个模块，并对每一个模块中重要节点的常规路径调控策略进行了详细总结；另外，本文重点介绍酪氨酸衍生物微生物合成中近期开发的新兴代谢工程技术与策略，以期为构建酪氨酸及其衍生物高产工程菌株提供参考。

01

典型酪氨酸衍生物的生物合成途径

近年来，多种酪氨酸衍生物被研究表明具有重要的生物活性和药用价值，其天然来源主要为药食同源植物。为实现其绿色异源生产，酪氨酸衍生物的生物合成路径逐步被解析。酪氨酸衍生物的生物合成基础代谢途径包括糖酵解途径、磷酸戊糖途径和莽草酸途径，然后以此经过多种路径酶催化合成目的产物（图1）。糖酵解途径以葡萄糖为底物可以生成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），磷酸戊糖途径通过葡萄糖代谢产生赤藓糖-4-磷酸（E4P），两者是酪氨酸及其衍生物合成的重要前体物质；PEP和E4P在3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸（DAHP）合成酶作用下缩合生成DAHP，然后通过一系列路径合成酶作用依次生成3-脱氢奎尼酸（DHQ）、莽草酸（SHIK）和分支酸（CHA）；CHA在分支酸变位酶作用下生成预苯酸（PPA）后，经预苯酸脱氢酶（TYRA）催化得到酪氨酸的重要前体物质4-羟基苯丙酮酸（4-HPP），4-HPP在L-酪氨酸氨基转移酶（TAT）作用下最终生成酪氨酸，并以L-酪氨酸为前体生成多种酪氨酸衍生物。

酪醇是一种典型的酪氨酸衍生物，主要存在于葡萄酒和橄榄中，具有抗炎、抗氧化和抗癌的作用。酪醇天然合成途径有两条，第一条途径是：酪氨酸在芳香醛合酶（AAS）催化作用下，通过脱氨基引入双键生成4-羟基苯乙醛（4-HPAA），4-HPAA分子的醛基被还原为羟基，转化为酪醇。第二条途径是：酪氨酸通过酪氨酸转氨酶将自身的氨基基团催化为相应的酮基基团生成4-HPP，然后4-HPP在丙酮酸脱羧酶催化下通过脱羧基引入双键进一步转化为4-HPAA，最后4-HPAA还原生成酪醇。酪醇天然合成途径的挖掘为其在微生物中的异源合成提供了指导，例如Liu Xue等将酪醇的第二条合成途径异源表达于大肠杆菌中，成功构建了从头合成酪醇的细胞工厂。另外，酿酒酵母被研究表明自身存在Ehrlich路径，可以内源合成酪醇，这将更有益于酪醇及其衍生物在酿酒酵母中的微生物合成。酪醇作为重要的中间物质，可以进一步在关键合成酶的作用下衍生苯乙醇化合物。研究表明，4-羟基苯乙酸-3-羟化酶（HpaBC）是一种依赖于铁硫簇和黄素腺嘌呤二核苷酸的双功能酶，能够选择性地将反应物中的特定位置进行羟基化，酪醇在HpaBC的催化下可生成羟基酪醇。其主要植物来源为橄榄和绿茶等植物，具有抗氧化、抗炎症及预防心血管疾病等功效。此外，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶（UGT）可以催化酪醇和尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-Glc），将UDP-Glc的糖基部分转移到酪醇上，形成红景天苷。其主要植物来源为红景天，红景天苷除抗菌、抗衰老等生物活性外，还具有抗疲劳的功能，对预防脑损伤和心血管疾病也有积极影响。

酪氨酸在HpaBC的催化作用下可以发生羟基化反应生成左旋多巴，左旋多巴主要存在于温莎豆、黎豆、蚕豆等豆类植物，可以促进大脑中多巴胺的分泌，改善帕金森病的症状。以左旋多巴为底物，可以进一步生成具有生物活性的儿茶酚胺类递质。明晰左旋多巴的生物合成路径后，Muñoz等在生产酪氨酸的工程大肠杆菌中，利用内源的HpaBC实现了左旋多巴的从头合成，并对其工程菌株进行代谢调控后，使左旋多巴的产量达到1.51 g/L。

丹参素是一种芳香酚类化合物，其植物来源为中草药丹参，丹参素能够促进组织修复和再生、改善心血管系统问题，可用于动脉粥样硬化、心脏病等疾病。丹参素的天然获取方式主要是从植物根部分离得到或通过化学方法合成，但这两种方法的效率都很低。其天然植物中丹参素的合成途径较为复杂，解析不够透彻。因此，研究学者尝试在微生物中构建丹参素的人工合成途径，例如Yao Yuanfeng等在大肠杆菌中开发了一种前所未有的丹参素人工生物合成途径，可直接从葡萄糖生产丹参素。在这一途径中，D-乳酸脱氢酶（D-LDH）和HpaBC起着关键作用，D-LDH属于氧化还原酶，能够催化丙酮酸转化为D-乳酸。4-HPP通过D-LDH的作用将酮基还原为羟基生成D-4-羟基苯乳酸，然后在HpaBC的催化作用下由D-4-羟基苯乳酸生成丹参素。该团队对工程菌株进行多模块化工程优化丹参素的合成途径后，使丹参素的产量达到了7.1 g/L。

对香豆酸的芳香族氨基酸前体为苯丙氨酸（Phe）或酪氨酸，其中酪氨酸在TDC的作用下通过去氨基，同时引入双键被直接催化生成对香豆酸。对香豆酸的天然植物来源为豆科、葫芦科、禾本科等植物，具有抗菌、抗氧化以及抗肿瘤作用，也可用于制作局部麻醉剂、杀菌剂和止血药。另外，对香豆酸也是一种重要的中间体，可被转化为多种具有生理活性的高值产品，如咖啡酸、绿原酸、迷迭香酸等，因此对香豆酸的市场需求旺盛，对香豆酸的绿色、大规模合成方式也正在被逐步开发。咖啡酸作为对香豆酸的衍生物，也具有止血、抗氧化、预防癌症、老年痴呆症以及心血管疾病等积极作用。

对香豆酸只需一步HpaBC反应即可生成咖啡酸，而且以咖啡酸为前体还可以进一步合成多种酪氨酸衍生物，例如在BDC的催化作用下脱羧并引入双键产生3,4-二羟基苯乙烯、在CAMT作用下通过甲基化反应，引入一个甲基基团形成阿魏酸、以及和丹参素在RAS作用下进行缩合生成迷迭香酸等。其中，阿魏酸和迷迭香酸也是植物天然产物，来源于伞形科、毛茛科及禾本科的植物中，而且阿魏酸在川芎、当归和木贼等中药材中含量较高，具有丰富的生理活性和药用价值；迷迭香酸也被研究表明具有突出的抗炎活性，可以用于抗关节炎、抗结肠炎等疾病，因此，它们的异源合成研究也被引起了广泛关注。此外，苯乙酯和苯乙酰胺也是咖啡酸的重要衍生物，这两者的天然资源非常匮乏，但研究发现微摩尔浓度级别的苯乙酯就对于多种癌症具有抑制作用，而苯乙酰胺则能够表现出强大的抗氧化能力，所以咖啡酸的从头合成路径构建及调控研究不仅有益于其自身的制备，且为诸多活性衍生物的合成奠定了良好的基础。

柚皮素也可以对香豆酸为前体物经过一系列酶促反应生成，其是柑橘类水果等植物中的次生代谢产物，不仅具有抗氧化、抗炎、抗真菌的活性，还可以抑制结肠、胃、肝等的肿瘤生长。研究发现，在TDC的催化作用下，酪氨酸生成对香豆酸后，可以经4CL催化进而生成对香豆酰-CoA；然后对香豆酰-CoA在CHS催化作用下缩合形成柚皮素查耳酮，最后在CHI的催化作用下合成柚皮素。柚皮素的生物合成途径近年来被解析得较为透彻，其异源合成路径的构建、代谢途径的调控、工程菌株的定向进化以及代谢网络的精细调控已经取得了不错的进展。对香豆酰-CoA作为一种重要的中间产物，除了作为底物合成柚皮素外，还可以在STS的作用下，发生缩合反应形成白藜芦醇。白藜芦醇是灌木浆果、花生、蔓越莓和藤本植物中常见的天然产物，具有抗炎、抗衰老作用、降低心脏病和糖尿病的风险的作用。综上所示，多种酪氨酸衍生物的健康功效及生物合成路径已经被表征与解析，表1对典型的酪氨酸衍生物的主要植物来源及健康功效进行了系统归纳。

由上可知，为促进酪氨酸衍生物的绿色高效生产，目前已有多种衍生物通过异源表达系统在模式微生物中实现了从头合成。为提高细胞工厂中终端产物的产量，对代谢路径进行调控是必要策略，以下对酪氨酸及其衍生物的代谢途径调控策略进行了总结。

02

模块化工程调控酪氨酸衍生物的代谢途径

在新兴的合成生物学背景下，利用代谢工程改造微生物构建高值化合物细胞工厂的技术正在卓越发展。代谢途径的模块化使得研究学者更方便及清晰地对复杂的代谢通路进行调控设计，有助于提高具有异源代谢网络的细胞工厂的性能。此外，组合模块化代谢工程有利于完善具有期望表型的人工生物系统，使得高附加值化合物细胞工厂的运转更加高效。对于酪氨酸及衍生物的微生物合成途径而言，可以根据其限速节点将代谢途径分为4 个模块进行分级调控（图2）：模块1：中心碳代谢途径的碳代谢流调控；模块2：解除磷酸戊糖途径和莽草酸途径中关键酶的反馈抑制作用；模块3：强化产物合成路径代谢流；模块4：弱化竞争路径碳通量。

2.1 模块1：增加中心碳代谢途径中前体物的供给水平

由于酪氨酸及衍生物的异源合成路径主要涉及糖酵解途径、磷酸戊糖途径、莽草酸途径和芳香族氨基酸及衍生物的合成路径，因此第一个限速节点是糖酵解途径和磷酸戊糖途径的代谢流分布，其中PEP和E4P作为芳香族氨基酸及衍生物的重要前体物质，两者的合理调控与目的产物的产量密切相关。众多研究表明，E4P和PEP的供给增加可以提高微生物异源合成芳香族氨基酸及衍生物的产量。PEP和E4P的碳代谢流调控主要从增加两者的供应和平衡两者的碳通量两个方面出发。

首先，为增加PEP和E4P的通量，研究学者通过“开源”和“截流”2 个方法实现。“开源”方法：通过强化PEP和E4P合成途径中的关键酶，可以增加两者的代谢流，例如强化丙酮酸向PEP的转化所需的PPSA可以增加PEP的含量、强化甘油醛3-磷酸和F6P向E4P的转化所需的转酮醇酶可以增加E4P的含量。“截流”方法：敲除或弱化PEP和E4P的竞争途径亦可以节省更多的代谢流流向PEP和E4P的方向，例如在大肠杆菌中，研究表明负责葡萄糖提取和磷酸化的PTS会消耗大约50%的PEP，因此失活PTS系统（敲除葡萄糖特异性转运蛋EIIBGlc编码基因ptsG和EIIAGlc编码基因crr）或更换可以替代PTS的系统（葡萄糖激酶途径）策略则被用于细胞工厂中PEP通量的调控。而且，阻断PEP到丙酮酸的转化（敲除pyka、pykf）可以调控PEP更多流向芳香族氨基酸的合成。类似地，利用“开源”和“截流”的方法对其他PEP和E4P合成和消耗的关键酶（PEP羧激酶、PEP羧化酶、转醛酶等）进行调控，都可尝试用于改善芳香族氨基酸及衍生物的产量。

其次，文献表明微生物中E4P的代谢通量远远少于PEP，两者之间的代谢流是否平衡对于氨酸及其衍生物的得率有重要影响。因此，利用代谢工程策略调控两者的碳通量改善不平衡性也被广泛研究，主要是通过“开源”的方法，增加E4P的供应，减少PEP和E4P的含量差距。除过表达E4P合成路径的关键酶的编码基因来强化其合成路径外，Guo Wei等通过外源引入磷酸转酮酶实现了F6P到E4P的转化，由此使得E4P的合成由双路径-内源路径和人工路径同时合成，增加了E4P的通量，也改善了其与PEP的通量不平衡性，研究结果显示该策略使得酪氨酸衍生物-酪醇的产量提高了33.44%。

2.2 模块2：解除关键酶的反馈抑制作用

解除目的产物对关键酶的反馈抑制作用可以有效提高芳香族化合物的产量，通过分析关键酶的三维结构并对其进行定点突变，可以实现解除关键酶反馈抑制的效果。例如在大肠杆菌中，芳香族衍生物的主要反馈抑制节点有AROG（DAHP合成酶）和TYRA，分别受到Phe和酪氨酸反馈抑制，通过对其进行定点突变后，可得到抑制反馈突变体arogD146N和tyraM53I/A354V，研究结果证明过表达抑制反馈突变体有效增加了SHIK的代谢通量，并进而提高了酪氨酸及多种衍生物的产量。类似地，酿酒酵母中对莽草酸途径中的关键酶3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶和分支酸变位酶进行突变（aro4K229L和aro7G141S），也被证明可以使之对酪氨酸的反馈抑制不敏感，进而增加酪醇、羟基酪醇、红景天苷、白藜芦醇等多种酪氨酸衍生物的产量。此外，在大肠杆菌中，芳香族氨基酸合成途径中存在一种抑制因子TYRR，可以抑制酪氨酸合成途径上的很多关键基因的转录，包括arol和tyra，敲除该抑制因子的编码基因也被证明可以增加大肠杆菌中酪氨酸的产量。目前，敲除tyrr的策略已经被用于代谢工程改造大肠杆菌合成多种酪氨酸衍生物并取得了预期效果。

2.3 模块3：强化产物合成路径

利用代谢工程策略强化产物合成路径的碳通量可以有效增加目的产物的产量，常用的策略包括过表达路径关键基因、引入外源路径拉动代谢流、对外源路径的基因进行密码子优化提高其编码酶的表达量等。在酪氨酸生物合成途径中，莽草酸途径中各种合成酶有可能成为关键限速节点，因此可以通过强化莽草酸途径中关键合成酶编码基因的表达水平，解除途径中的代谢瓶颈，强化酪氨酸的合成路径碳通量，从而提高酪氨酸衍生物的生物合成产量。Bai Yanfen等通过对大肠杆菌中莽草酸途径的aroe、arod和arobopt进行过表达，显著增加了代谢途径中通往酪氨酸及其衍生物的代谢流，实验结果表明上述基因过表达后使酪醇的产量由752.6 mg/L增加到了926.9 mg/L。然而，并不是所有的基因过表达对酪氨酸衍生物的产量提高有积极影响，Liu Huayi等的研究表明，在酿酒酵母中虽然对多个路径合成酶以及外源arol进行了过表达，然而仅aro2的过表达显著提升了酪醇的生物合成效率。因此，关键限速靶点的选择还需要经过更精确策略预测及实验鉴定。E4P和PEP经过莽草酸途径合成酪氨酸后，酪氨酸在各种催化酶的作用下合成各种高值衍生物。莽草酸途径中的关键合成酶过表达已经被验证可以增加酪氨酸及其衍生物的产量。从酪氨酸到目的衍生物合成途径中的关键酶也可以被进行强化从而提高终端产物的产量。例如多酚类化合物，其合成途径涉及包括TDC、4CL、肉桂酰-CoA还原酶、乙醇脱氢酶和HpaBC在内的多种酶，对这些关键酶进行过表达已经被验证可以改善多种黄酮类化合物的产量。

除了强化内源合成路径外，引入外源基因拉动代谢流也是常规策略，鉴于细菌的密码子偏好性与真菌的密码子偏好性有显著差异，对外源基因进行密码子优化后再过表达可以显著提高酪氨酸及其衍生物的产量。例如Yang Cui等研究发现来源于酿酒酵母的苯丙酮酸脱羧酶具有许多密码子是大肠杆菌中很少存在的，通过对苯丙酮酸脱羧酶进行大肠杆菌偏好性密码子优化后，大肠杆菌中苯丙酮酸脱羧酶的表达水平显著提高。引入外源基因除了可以辅助构建产物的从头合成路径和强化内源路径代谢流外，还可以形成双路径或多路径拉动流向目的产物的碳通量，例如酿酒酵母中酪氨酸的重要中间产物4-HPP，其既可以在Ehrlich路径中苯丙酮酸脱羧酶作用下脱羧形成4-HPAA，也可以在芳香氨基酸转氨酶作用下与酪氨酸相互转化，为最大化4-HPAA及其衍生高值产物的产量，Guo Wei等引入来源于荷兰芹（Petroselinum crispum）的AAS构建酪氨酸到4-HPAA的直接转化路径，由此酪醇可通过酵母天然合成路径（ARO10-ADHs路径）和人工构建路径（AAS-ADHs）同时被4-HPAA转化合成，产量得到显著提升。而且，引入外源路径也可以对合成目的产物所需的辅因子进行再生和补充，例如Chen Ruibing等通过引入多个外源基因，构建了3 种辅因子（还原型黄素二核苷酸、S-腺苷甲硫氨酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）的供应和循环利用系统，实现了酚酸、咖啡酸和阿魏酸的高效合成。

2.4 模块4：弱化竞争路径

敲除或弱化竞争路径基因可以减少中间产物的流失，避免碳代谢流的浪费，提高目的产物合成代谢流。同属于芳香族氨基酸，Trp和Phe的合成与酪氨酸及其衍生物的生物合成对碳源处于竞争关系。分支酸盐既可以在和TAT作用下合成酪氨酸，也可以在分支酸酶和邻氨基甲酸酯合酶作用下分别生成Phe和Trp。因此敲除phea基因以调控流向Phe的代谢流流往酪氨酸是常用的代谢工程策略，Wang Huijing等在工程大肠杆菌中敲除phea基因后羟基酪醇的产量由1.10 g/L提高至1.43 g/L。芳香族氨基酸前期合成途径中分支路径的代谢流弱化也是该模块工程的调控节点，例如酿酒酵母中PEP可以在PDC1/5/6等酶作用下被一步步转化为乙醇，使得酪氨酸的前体物质减少，因此，弱化乙醇的合成路径被研究学者用来改善酿酒酵母中酪氨酸及衍生物的合成，其他类似的分支节点也可被尝试弱化用于提高终端产物的产量。

综上所示，利用途径模块化工程技术已经有效解除了酪氨酸及衍生物中的限速节点，表2对具体的代谢工程策略以及涉及到的基础代谢路径关键酶进行了总结。

此外，组合模块化代谢工程有利于完善具有期望表型的人工生物系统，使得高附加值化合物细胞工厂的运转更加高效。然而，多模块化的引入会加重细胞代谢负担，影响细胞生长和目标产物的产率，因此需要合理调控代谢网络，这需要更精密的新兴技术和精准调控策略解决。

03

新兴技术和策略精细调控酪氨酸衍生物的代谢网络

为了使高附加值化合物细胞工厂的运转更加高效，需要对细胞代谢网络进行精细调控，这促进了新兴技术和策略的兴起，例如GEMs构建技术、CRISPR基因编辑技术、生物传感器构建策略以及动态基因电路构建策略等。

3.1 基因组尺度代谢途径模拟

GEMs是一种能够通过基因组信息和代谢数据对生物体内已知的代谢反应及其产物进行系统性描述的数学模型（图3）。模型建立在已知的代谢物化学计量数和完整的基因-蛋白质-反应物关系上，可对微生物或微生物群落的代谢特征进行模拟和仿真，并在稳态下求得目标方程的最优解。近年来，GEMs已被成功应用于系统生物学和代谢工程方面的研究中，用于指导菌株设计、预测细胞表型、分析代谢机制、挖掘未知代谢途径以及研究菌株进化，成为了系统揭示细胞生长和代谢调节的重要研究工具。

目前，研究学者在大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌及乳酸菌等微生物中均已建立了不同类型的GEMs，可以作为新陈代谢的功能数据库和高通量数据背景化的支架，促进以代谢为中心的多组学综合分析。迄今为止，已报道了7 种GEMs用于枯草芽孢杆菌，9 种GEMs用于酵母菌。自2003年首次发表第一代酵母-GEM模型（iFF708）以来，该生物体的GEMs近20 年一直在进行反复完善和改进，目前建立了以酿酒酵母为中心的多种模型（包括ecYeast、etcYeast、pcYeast、Yeast9等），极大地促进了有关酿酒酵母的各种系统和合成生物学研究，例如Yeast9利用了大规模组学和表型数据集，系统地重建和分析了大量组学受限的GEMs，很好地预测了菌株的生长速率和基因功能。另外，非模式微生物底盘细胞中也开始使用GEMs技术，Lu Yao等对生产白藜芦醇的菌株Alternaria sp. MG1进行了全基因组测序并重建了该菌株的第一个GEMs-iYL1539，通过计算机模拟预测，发现可以通过添加乙醇加强乙酰辅酶A的合成来提高白藜芦醇的产量，并通过实验验证了预测正确，白藜芦醇产量最终增加了26.31%。此外该模型还预测了6 个基因为白藜芦醇合成路径的潜在限速靶点，利用代谢工程解除限速步骤后白藜芦醇产量增加了33.32%。该研究为GEMs技术在酪氨酸衍生物的合成代谢调控中提供了重要借鉴，但其策略的普遍适用性仍需进一步验证，如菌株在不同培养阶段的代谢状态切换（如对数生长期与稳定期），可能会导致静态模拟与动态发酵过程的偏差，GEMs和通量平衡分析联合用于菌株的建模和设计或能够有效解决这个问题，建议未来研究可以将其与实时代谢物检测技术联用，以构建一个动态的宏基因组尺度代谢模型，实现酪氨酸合成途径的实时闭环优化。

值得注意的是，虽然微生物中合成酪氨酸衍生物的GEMs已广泛建立，但在实际应用中仍面临模型准确性和计算复杂性的挑战，例如酪氨酸及其衍生物的生物合成途径中若存在未表征酶或旁路反应，便会导致预测偏差。此外，由于代谢网络的高维度特性，在涉及多细胞群落或动态代谢分析时，求解非线性目标方程的计算资源需求便会显著增加。未来或许可通过结合机器学习算法和动态代谢模型，提升GEMs对酪氨酸衍生物合成途径中非线性调控关系的解析能力。

3.2 基于CRISPR工具编辑多重基因

基因组编辑是改造工程微生物的基础技术，快速高效的基因编辑工具将会显著提高菌株改造的速度和准确度。CRISPR是实现基因组特定位点修饰的一种方便高效的工具（图4），通过基因的插入、删除和替换以及更为精细的碱基编辑，能够在许多微生物如大肠杆菌、酿酒酵母中进行精确和可控的基因修饰。微生物细胞工厂代谢工程面临的核心挑战是平衡异源、同源多基因通路的效率，避免毒性中间产物积累，通过启动子/核糖体结合位点文库筛选、多拷贝质粒表达等技术，结合基因编辑工具，已实现白藜芦醇、柚皮素等黄酮类化合物的高效生产，随着多重化与精准化CRISPR策略的发展，经优化的微生物细胞工厂正在彻底改变包括类胡萝卜素、黄酮类化合物、芪类化合物等药食同源化合物的生产效能。特异性识别与切割是CRISPR系统的两大核心功能，CRISPR阵列精确识别并定位特定的核酸序列，Cas蛋白则执行切割核酸的功能。而且，对于不同的靶向基因，无需改变Cas蛋白，只需设计引导RNA的短序列，就能重定向特异性位点切割。

基于CRISPR系统进行多重基因组编辑、全基因组编辑及代谢网络的调控已经广泛用于酪氨酸及其衍生物的细胞工厂构建。例如Wang Laiyou等开发了一种基于CRISPR-Cas9的多重基因组编辑方法，通过在酵母中进行多重基因敲除、多位点和多拷贝的整合，首次实现了白藜芦醇在多形汉逊酵母中的生物合成，并且与普通单拷贝工程菌株相比，白藜芦醇的产量增加了约20 倍，达到97.23 mg/L。需要注意的是，多重基因组编辑过程中可能存在基因编辑效率差异的问题，同时操作多个靶位点时，sgRNA的脱靶效应和同源重组效率的下降可能影响工程菌株的构建成功率，此外，多拷贝整合带来的代谢负担可能限制宿主细胞的生长性能，这在工业化扩大培养中需要特别关注。另外，基于CRISPR/Cas系统进行改造及优化的工具正在蓬勃发展，为多元代谢工程策略带来了新技术，例如基因特异性激活（CRISPRa）或抑制（CRISPRi）等。Cress等对CRISPR/Cas系统进行改造得到dcas9阻遏蛋白，使其能够同时抑制大肠杆菌中的多个靶向基因，并基于pCRISPReporter荧光报告质粒量化了dCas9介导的内源性启动子的阻遏作用，证明了dCas9介导的阻遏作用可以抑制大肠杆菌内源基因从而提高异源植物化学物质的产量。而且，将该工具实际用于柚皮苷的生物合成中下调靶向基因后，柚皮苷产量提高了64.0%，说明该技术可以很好地辅助代谢工程。然而，该技术在动态调控方面仍有局限性，dCas9与DNA的结合具有持续性，可能难以实现精确的时序控制，造成代谢通量的失衡，建议可以结合代谢通量分析进行系统优化。同时，不同启动子区域的空间位阻差异可能影响阻遏效率的稳定性，需要通过sgRNA设计的优化和蛋白质工程进行改进。不同底盘细胞的CRISPR工具适配性差异也会增加技术移植的难度，在实际应用中可以针对具体宿主进行工具定制化开发。

3.3 基于生物传感器优化代谢途径

生物传感器是筛选菌株库或监测菌株性能的有效工具（图5），包括基于转录因子的生物传感器、基于核酸的生物传感器和基于蛋白质的生物传感器，有助于工程菌株的构建。在生物体中，某些蛋白质、DNA或RNA分子可以感知各种代谢物或环境信号变化，并产生可测量或可操作的响应，基于此性能可以构建生物传感器。近年来，将化学信号如天然产物浓度等信息转化为可测量输出的生物传感器机制已广泛应用于工程学和合成生物学领域。

诸多研究表明生物传感器在细胞工厂中的构建成功方便了终端产物高产菌株的筛选，如对香豆酸、阿魏酸、柚皮苷查耳酮、柚皮素等。Siedler等利用基于转录因子的生物传感器实现了生产对香豆酸的工程酿酒酵母高产菌株的筛选，由于枯草芽孢杆菌中存在对香豆酸的生物传感器-阻遏蛋白PadR，PadR可以与对香豆酸结合从而使PadR脱离启动子区域启动后续报告基因的表达，因此该团队尝试将上述生物传感器应用于酿酒酵母中对香豆酸的生物合成以对高产菌株进行筛选。然而，由于生产稳定性等限制条件，基于PadR的生物传感器不适于直接表达于酿酒酵母中。因此，Siedler等将基于PadR的生物传感器异源表达于大肠杆菌中，并将生产菌株和生物传感器感应菌株共同包埋于液滴中利用微流控设备进行检测筛选，该方法成功地实现了通过荧光信号即可筛选高产对香豆酸的工程酵母菌株。丙二酰-CoA作为许多天然产物生产过程中重要的代谢物，研究人员已经建立了多个生物传感器，如基于枯草芽孢杆菌的FapR转录因子的荧光生物传感器，将该传感器与全基因组过表达文库相结合，明确了两个改善细胞内丙二酰-CoA浓度的靶向基因，利用代谢工程技术进行调控后使得丙二酰-CoA的衍生物3-羟基丙酸产量提高了120%。随后，又有研究人员开发出了一种基于III型聚酮化合物合酶的比色生物传感器来检测丙二酰-CoA，简化了微生物代谢工程流程，并拓展了丙二酰辅酶A在工业细菌中的应用，可用于检测大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌和恶臭假单胞菌，该传感器可以通过比色筛选即可鉴定丙二酰辅酶A积累量增加的菌株，通过进一步构建调控RNA的文库，筛选并解除限速基因靶点，在不同菌株中提高了衍生物白藜芦醇和柚皮素的产量，使其分别达到51.8 mg/L和103.8 mg/L。

3.4 基于动态基因电路调控代谢网络

利用基因电路控制微生物细胞工厂基因有效表达是提高碳源利用率的常用策略（图6）。由于细胞生长和生产之间存在碳源竞争的冲突，而且某些化合物积累被研究表明对细胞底盘有损害作用，近年来研究人员已经相继开发了多种动态调节策略控制天然途径和工程途径，用于分离细胞生长和产物合成，以期在不破坏细胞稳态的情况下平衡产物的合成。动态调控系统通常基于对外部诱导剂、细胞内代谢物、环境因素或细胞生长有反应的不同生物传感器而设计。

本研究团队构建并结合基于酿酒酵母中敲除阻遏蛋白GAL80的葡萄糖浓度响应型基因电路动态调控羟基酪醇的生物合成，实现了酵母中羟基酪醇的双阶段发酵，前期葡萄糖浓度高时，碳源主要用于生长，第二阶段葡萄糖浓度低时，开启羟基酪醇的生产途径，碳源主要用于生产。此动态基因电路避免了酵母细胞生长和生产的碳源冲突，有益于碳源的合理利用并显著提高了羟基酪醇的产量。基于群体感应的动态调控可以将细胞生长与代谢物的生产结合起来，Zhou Shenghu等基于代谢物柚皮素和对香豆酸生物传感器，设计并优化了一个可以实时监测单细胞生长代谢状态的3 层动态调控网络，该动态系统实现了柚皮素合成相关的多个基因的动态调控，显著提高了柚皮素的产量，使其在摇瓶中的产量达到523.7 mg/L，是未使用动态调控系统菌株的8.7 倍。值得注意的是，动态基因电路调控代谢网络在酪氨酸衍生物合成中仍面临挑战，如基于生物传感器的多层调控网络可能因代谢物的反馈抑制或跨途径竞争而导致动态响应失准。未来研究或许可以通过结合系统代谢模型来定量解析酪氨酸节点调控与衍生化途径的互作机制，以提升动态调控的适配性。

综上所示，本部分系统综述了近几年合成生物学中典型的新兴代谢工程技术与策略，及其在微生物细胞工厂中合成酪氨酸及其衍生物的应用研究。为促进相关领域研究发展，本文将上述新兴技术在典型酪氨酸衍生物合成中的应用案例归纳于表3。

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结 语

药食同源植物中存在多种活性物质，既具有食用价值，又具备药用价值，其中酪氨酸及其衍生物为典型的一类高值化合物。随着社会发展及人们健康需求增长，植物源酪氨酸及其高值衍生物的应用日益广泛，其绿色高效获取方式成为研究热点。随着合成生物学、系统生物学的发展，微生物细胞工厂在合成酪氨酸衍生物方面展现出了巨大的潜力。为实现高附加值酪氨酸衍生物在细胞工厂中的高效生物合成，对其代谢途径进行调控是至关重要的。常规模块化工程策略是实现代谢途径合理调控的有效策略，根据酪氨酸衍生物合成途径的限速节点，可以分为4 个模块进行调控：1）增加中心碳代谢途径中前体物的供给水平；2）解除关键酶的反馈抑制作用；3）强化产物合成路径；4）弱化竞争路径。为进一步实现代谢网络的高效精细调控，多种新兴代谢工程技术如GEMs、CRISPR工具、生物传感器、动态基因电路已逐步建立，并在改善酪氨酸衍生物的微生物合成方面取得了显著进展。

然而，要实现高效、稳定且经济可行的大规模生产，仍然面临着诸多挑战，如GEMs在实际应用中面临的模型准确性和计算复杂性的挑战，以及CRISPR/Cas9等基因编辑工具的精确编辑能力有待提高。此外，大规模生产还面临菌株稳定性的问题，工程菌株在长期发酵过程中的遗传稳定性不足，细胞适应性进化会引发代谢网络重编程异常，导致产物得率衰减。为应对挑战，本文提出以下针对性解决策略，旨在为微生物细胞工厂高效、稳定大规模生产酪氨酸衍生物提供理论支持。未来的代谢工程调控研究可以通过结合基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等多组学数据，构建更为精确的数学模型，以全面解析代谢网络的动态变化规律。另外可以基于当前的CRISPR/Cas9信息进一步探索新型碱基编辑器等高级编辑技术，提高编辑效率和特异性，增强对复杂代谢途径的精细调控能力。此外，着重解决跨物种遗传元件的兼容性问题，进一步开发自适应调控元件以及设计跨尺度生物反应器，以便能更好地整合不同来源的功能模块。除优化新兴代谢工程技术外，可以减少菌株的质粒依赖，增强基因组稳定性，并对工程菌株进行适应性进化管理和遗传稳定性检测，进而减弱细胞适应性进化，提高菌株稳定性。当前，新兴技术与策略在酪氨酸及其衍生物的生物合成中应用不够广泛和深入，未来可以加大合成生物学工具箱如生物传感器与动态基因电路的设计、引入智能感知与反馈控制等，使酪氨酸及其衍生物的调控策略更加精准高效。

第一作者：

周丹丹助教，齐鲁理工学院生物与化学工程学院教师。2023年毕业于山东农业大学，主要研究方向分子微生物学，现从事合成生物学中高值化合物合成方面的研究，在《Molecular Plant-Microbe Interactions》等发表SCI论文2篇和中文核心2 篇。

通信作者：

刘英杰副教授，齐鲁理工学院生物与化学工程学院教师。2024年毕业于江南大学获博士学位，经人才引进就职于齐鲁理工学院生物与化学工程学院。主要从事合成生物学及系统生物学方向研究，专注于利用代谢工程技术改造微生物构建细胞工厂，实现高值功能因子的绿色制备。以第一作者或通信作者在《Bioresource Technology》《Journal of Agricultural and Food Chemistry》（封面文章）、《ACS Synthetic Biology》（封面文章）、《Food Research International》等发表论文10余篇，其中2篇为封面文章。主持齐鲁理工学院科技人才项目1 项，并以主要完成人身份参与国家重点研发计划子课题、国家自然科学基金面上项目、黑龙江省创新人才培养计划等多项课题。

本文《微生物合成酪氨酸衍生物的代谢途径调控策略研究进展》来源于《食品科学》2025年46卷第13期28-40页，作者：周丹丹, 马营, 刘英杰。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20241230-253。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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