mRNA原液DNA模板残留质量标准制定与分析方法优化。

本期内容主要围绕两个问题：

• mRNA原液中DNA模板残留质量标准是如何设定的？

• DNA模板残留的分析方法有哪些？有哪些还可以改善的地方？

mRNA原液DNA模板残留质量标准制定依据

mRNA原液成品中的DNA残留有两种类型，一种是宿主DNA残留（HCD），一种是线性化质粒DNA模板残留（工艺相关杂质）。宿主DNA残留是超螺旋质粒的关键质量属性，而线性化质粒DNA模板是mRNA原液制备的起始原材料。如果超螺旋质粒中的宿主DNA残留符合质量标准，则后续mRNA原液无须检测宿主DNA残留，只需重点关注线性化质粒DNA模板残留。

在IVT反应中，通常而言，每毫升反应液中需要加入50ug 线性化质粒DNA模板，若RNA产量为5mg/mL，那么DNA模板初始值为1%。IVT反应结束后，需要加入DNaseⅠ降解线性化DNA模板。那么，mRNA原液中的DNA模板残留需要达到什么范围才符合法规要求呢？

为此，我查找关于生物制品终产品（Drug Product）中的宿主DNA残留质量标准的相关法规和指导原则，希望可以为mRNA原液中的线性化质粒DNA模板残留的质量标准找到法规依据。

• 2020年8月15号，CDE发布《新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（试行）》，其中杂质分析提及：mRNA原液中的DNA残留与传统疫苗中来源于细胞基质的DNA残留不同，系特定DNA序列的残留，应当结合模板序列、残留量、残留DNA片段大小等评价DNA模板残留的安全性风险。

• 2022年5月26号，CDE发布《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》，其中工艺相关杂质提及：生产若使用了肿瘤细胞系(如 Hela 细胞)、致瘤细胞系,或携带有致瘤基因、病毒来源序列的细胞(如HEK293T细胞)在确保无完整活细胞残留的同时,需对DNA的残留量和残留片段大小进行控制,合理拟定标准限度。如有可能,建议尽量将残留DNA控制在10ng/剂以内, DNA残留片段的大小控制在 200bp 以下。

• 2021年，国药中生杨晓明等人在国际生物制品学杂质发表综述文章：生物制品中宿主细胞残留DNA检测的研究进展，文章中提到：中国药典2020版三部规定，以细胞基质生产的生物制剂DNA残留量不能超过100pg/剂，以细菌或真菌基质生产的疫苗DNA残留不能超过10ng/剂。我没有在药典三部中找到上述文字的原始描述，但是，查找具体品种的检定标准时，发现相似的宿主DNA残留鉴定标准，例如，冻干型乙型脑炎灭活疫苗（Vero细胞）成品中宿主DNA残留量的检定标准设定为不高于100pg/剂，重组乙型肝炎疫苗（酿酒酵母）成品中宿主DNA残留量的检定标准设定为不高于10ng/剂。

在上述法规或者指导原则中，生物制品终产品中的宿主DNA残留质量标准上限为10ng/剂，这恰恰也是BNT162b2原液DNA模板残留质量标准制定的依据。在EMA公开的BioNTech 新冠mRNA疫苗（BNT162b2）质量部分的评估报告中，原料药3.2.S.4.5 质量标准制定依据中提及：根据WHO生物药相关指导原则建议，将mRNA原液中残留DNA模板的质量标准设定为不超过10ng/剂。BioNTech 新冠mRNA疫苗每剂量为30μg，由此计算出mRNA疫苗商业化生产的放行标准为≤330ng DNA/mg RNA。

mRNA原液DNA模板残留分析方法

中国药典2020版三部通则3407规定，对外源DNA残留量测定推荐了三种方法：DNA探针杂交法、荧光染色法和定量PCR法。美国药委员会（USP）发布的mRNA疫苗和质量产品质量分析方法-指南草案建议采用定量PCR检测mRNA原液中的DNA模板残留。BNT162b2原液中DNA模板残留的检测方法也是采用qPCR，其检测的靶序列为包含T7启动序列的69个碱基对。

qPCR对于特定序列的定量检测毫无疑问是非常准确的，但是，用qPCR检测到的特定靶序列是否可以精确表征整体的DNA模板残留呢？要回答这个问题，还有很多疑问需要去验证：检测到的靶序列数量是否与线性化质粒的其余降解片段成正比例的？在DNaseⅠ降解线性化DNA模板的产物中降解片段的长度分布是怎么样的？T7启动子属于靶序列的一部分，而T7聚合酶对于T7启动子具有高亲和力，那么由于T7聚合酶的遮蔽是否会导致部分靶序列被检测不到呢？这些 疑虑 长久以来未得到充分解决，因此不断有人质疑获批的新冠mRNA疫苗中的DNA残留超标。

有研究者（Methodological Considerations Regarding the Quantification of DNA Impurities in the COVID-19 mRNA Vaccine Comirnaty®）采用Qubit荧光定量系统检测Comirnaty新冠疫苗中的DNA残留，居然要比质量标准10ng/剂高出数百倍。

有研究者(Quantification of objective concentrations of DNA impurities in mRNA vaccines) 向5ng DNA中加入含量递增的RNA(0~5μg)，用Qubit荧光定量系统定量检测DNA。当混合物中，加入的RNA含量低于10倍DNA含量时，Qubit可精确定量DNA含量，然而，当混合物中RNA含量远超过10倍DNA含量时，Qubit检测定的DNA含量远高于实际的DNA含量。这说明荧光染料不仅可以结合DNA，也可能结合RNA，我们可以推测mRNA疫苗中存在的大量RNA可能会导致Qubit荧光定量系统检测到的DNA含量异常偏高。研究人员在新冠mRNA疫苗样品中加入RNase去除掉RNA，采用Qubit检测到的DNA含量要比未加入RNase的下降了100倍。

小结

在mRNA疫苗的生产中，宿主DNA残留属于超螺旋质粒的放行标准，而线性化质粒DNA模板残留属于mRNA原液的放行标准。根据相关法规，在临床申报阶段，可将mRNA原液中DNA模板残留质量标准设定为不超过10ng/剂量，并且选择qPCR作为DNA模板残留的检定方法。个人觉得，未来或许还应该采用荧光染色法（Qubit等）检测mRNA原液中整体DNA残留，对DNase I降解产物中的片段分布比例（CDE指导原则中重点提及的）也需要做更深一步的探究。

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