《食品科学》：东北林业大学王占斌副教授等：水杨酸对树舌菌丝三萜合成及活性氧含量的影响

药用真菌对人体健康有益，可降低慢性病的患病风险，研究表明药用真菌含有各种萜类物质，其中三萜类是重要的有效活性成分。树舌（

Ganoderma applanatum

(Pers.) Pat.）属于灵芝属（

Ganoderma

）、树舌灵芝亚属（

Subgen

（P. Karst.）Imazeki），为传统大型药用真菌。近年来树舌中发现多种药用活性物质，如多糖、甾类、三萜、脂类化合物、氨基酸、蛋白质、酚类和一些微量元素，其中三萜类化合物是主要研究对象。由于生长缓慢和在自然界中稀缺等因素，野生树舌子实体不能成为生产三萜等次级代谢产物的可靠来源。液体发酵具有培养周期短、发酵条件容易控制、产量和质量稳定等优点，因此可通过深层发酵培养树舌菌丝体生产生物活性物质。 水杨酸（SA）作为植物的抗逆信号分子，在防御调控系统中起重要作用。

东北林业大学林学院的郭培洁、王占斌*、夏永桥等利用 SA诱导树舌菌丝并分析其对总三萜产量的影响。采用非靶向代谢组学通过液相色谱-质谱（LC-MS）检测SA诱导下萜类物质的差异，找出参与三萜生物合成的关键差异代谢物，进一步分析差异代谢物在三萜生物合成途径中的地位及其在代谢通路中的作用。此外，分析树舌菌丝胞内抗氧化酶活性的变化，将代谢组学结果与ROS含量变化进行联合分析，挖掘SA影响树舌三萜生物合成途径中的关键位点，以期为提高树舌三萜含量的合成机制提供参考。

01

SA筛选结果

1.1 SA浓度对树舌三萜含量与生物量的影响

如图1所示，随着SA浓度升高发酵液中三萜含量呈现先上升后下降的趋势。SA浓度为250 µmol/L时，三萜含量达到最高，为60.793 mg/g，与对照组（42.329 mg/g）相比提高43.6%，SA浓度大于250 µmol/L时，三萜含量下降较快，浓度大于350 µmol/L时，三萜含量趋于平稳。另外，当SA浓度为50、100、350、400 µmol/L时，三萜含量分别为36.314、37.958、34.465、34.596 mg/g，均低于对照组三萜含量，这表明SA浓度过高、过低都会降低树舌三萜含量。这可能与ROS影响次级代谢物合成有关，SA浓度变化可能会引起树舌菌丝胞内抗氧化酶系统发生改变从而清除ROS，这在本研究抗氧化酶活性测定实验中得到证实。

为探究SA是否影响树舌三萜总产量，本实验进一步测定不同SA浓度下树舌菌丝生物量变化。如图1所示，对照组菌丝生物量为1.06 g/100 mL，SA处理组菌丝生物量维持在1.06～1.19 g/100 mL，总体差异不显著（

P

＞0.05）。这说明树舌菌丝液体发酵过程中SA浓度显著影响三萜类化合物生物合成，但对菌丝生物量影响不显著。

1.2 SA添加时间对树舌三萜含量与生物量的影响

根据1.1节结果，选用250 µmol/L作为最适浓度探究SA添加时间对树舌液体发酵的影响，如图2所示，不同时间添加SA能显著影响三萜含量，在第6天加入250 µmol/L SA，三萜含量最高，为67.413 mg/g，比对照组提高59.2%。在液体发酵前期（第0、2、4天）加入SA，三萜含量分别为58.558、63.004、64.596 mg/g，在后期（第8、10天）加入SA，三萜含量分别为55.868、42.948 mg/g，与前期相比三萜含量明显降低，这表明在液体发酵前期加入SA可以有效提高树舌菌丝三萜含量。

在液体发酵培养的不同时间分别加入SA，菌丝生物量在1.017～1.091 g/100 mL范围内，与对照组（1.06 g/100 mL）相比，整体差异不显著（

P

＞0.05），这表明在树舌液体发酵过程中SA不同添加时间显著影响三萜类化合物的合成，但不影响树舌菌丝生物量。

02

SA对树舌菌丝MDA含量的影响

MDA是细胞膜响应ROS产生的物质，可用于评估膜系统的受损程度，是生物体受损的第一响应指标。如图3a所示，在整个培养周期中MDA含量呈先上升后下降的趋势，第6天开始用250 µmol/L SA处理菌丝后MDA含量始终高于对照组，并在第8天达到峰值（1.056 U/mg），比对照组提高55.3%。树舌菌丝受到SA胁迫后，MDA含量增加能反映出菌丝受到氧化应激的影响，MDA含量高表明菌丝可能遭受氧化损伤，细胞膜和细胞器受到氧化应激的破坏。

03

SA诱导对树舌菌丝抗氧化酶活性的影响

SOD、CAT是细胞内的重要抗氧化酶，通过清除ROS自由基，保护细胞膜、细胞器和细胞核免受氧化损伤，维护细胞的完整性和功能。第6天开始用250 µmol/L SA处理菌丝，如图3b、c所示，在第8天，处理组SOD活性为49.058 U/mg，CAT活性为60.398 U/mg，分别比对照组提高25%、77%，在第10天，处理组SOD活性持续上升至70.148 U/mg，比对照组提高65%，处理组CAT活性下降，活性为58.723 U/mg，仍比对照提高81%。这表明树舌菌丝受到SA胁迫时，为减少氧化应激对细胞的损伤，其抗氧化能力增强，产生更多SOD、CAT清除细胞内ROS，有助于保护细胞免受氧化损伤。

04

基于代谢组学分析SA对树舌三萜合成的影响

4.1 样本QC质控分析

对QC样本进行Pearson相关性分析，相关性系数大于0.9表明相关性较好。如图4所示，QC样本间的相关性系数都在0.9以上，表明实验重复性较好。

4.2 样本主成分分析（PCA）

PCA可以把相似的样本聚到一起，距离越近表明样本间相似性越高。将所有实验样本和QC样本提取得到的峰进行PCA，QC样本间差异越小说明方法稳定性越高、数据质量越好，如图5所示，QC样本聚集在一起，说明数据可靠。

4.3 SA对树舌萜类化合物的影响

基于广泛非靶向代谢组学技术对树舌菌丝SA处理组（SA250）和未处理组（SA0）萜类成分分析，如图6所示，树舌菌丝共含22 种萜类化合物，其中单萜类3 种，占比13.6%；二萜类5 种，占比22.8%；三萜类2 种，占比9%；倍半萜类3 种，占比13.6%。具体成分见表1。

基于正交偏最小二乘判别分析模型，以VIP＞1、

P

＜0.05为标准进行差异代谢物筛选，结果见表1，在22 种萜类化合物中筛选出8 种差异代谢物质，其中倍半萜类法尼醇，单萜类龙丹苦苷，二萜类紫杉醇C、穿心莲苷、丹参酮、果烷-17,18-二酸，三萜类甲基-6-乙酰氧基角双酯显著上调。实验结果表明SA对树舌菌丝萜类物质生物合成具有显著影响。

通过对差异代谢物进行进一步相关性分析，如图7所示，倍半萜内酯，单萜类龙丹苦苷，二萜类紫杉醇C、穿心莲苷、丹参酮，三萜类甲基-6-乙酰氧基角双酯6 种萜类化合物相关系数较高，其中5 种在SA诱导下显著上调，占上调代谢物数量的71%，这表明SA对这5 种化合物的影响较显著。

4.4 SA处理多变量统计分析

利用多变量统计分析可以进一步解析SA处理下萜类物质与ROS的联系。热图能够将变量可视化，直观地显示两个样本中萜类物质和抗氧化酶活性的变化。如图8所示，萜类物质中环烯醚萜苷、甜菊糖苷、法尼醇、丹参酮、龙丹苦苷、紫杉醇C、穿心莲苷、果烷-17,18-二酸、甲基-6-乙酰氧基角双酯与CAT、SOD、MDA等变量在SA处理组中显著富集且丰度较高，而在对照组中丰度极低。进一步证明了SA处理下树舌菌丝胞内ROS含量与萜类生物合成紧密联系。

4.5 SA对树舌三萜生物合成途径的影响

三萜合成的最初底物是乙酰辅酶A，经角鲨烯-2,3-环氧化物环化产生原甾醇，原甾醇通过主链重排，产生关键的中间代谢物羊毛甾醇，三萜属于高度氧化的羊毛甾醇衍生物。通过对萜类骨架生物合成途径、倍半萜类和三萜类生物合成途径分析，发现上调化合物法尼醇在三萜生物合成中占有重要位置。本实验模拟树舌三萜生物合成途径，如图9所示，结合两个KEGG途径分析发现法尼醇是参与树舌三萜生物合成途径中的关键前体位点，倍半萜合酶参与合成法尼醇，在羊毛甾醇形成之前，共有6 种酶参与形成7 种化合物。

05

在大型真菌培养中，添加外源诱导剂，如SA、MeJA、乙酸及阿司匹林等，能够通过调节胞内ROS信号、NO信号及线粒体功能等提高三萜的生物合成。如MeJA处理上调参与

-亚麻酸代谢的13-脂氧合酶、氧化烯合成酶和氧化烯环化酶，导致内源MeJA积累，激活三萜生物合成转导。SA是一种潜在的植物生长调节剂，通过触发多种生理和代谢过程调节植物的生长发育，它不仅能调节植物的生长发育，还能诱导真菌次生代谢物的积累。目前有一些研究通过SA诱导大型真菌提高主要代谢产物，但SA对树舌的作用鲜见报道。本研究采用不同浓度SA、不同添加时间处理树舌发酵液菌丝，以确定SA对三萜含量的影响。结果发现SA处理在一定浓度范围内显著增加了总三萜的含量，其中在第6天加入250 µmol/L为最佳处理条件。Ong等发现低浓度SA对菌丝生长有促进作用，SA积累量增加，真菌生物量降低，这种作用随着时间的推移而下降。本实验中发现，SA不同浓度和不同时间处理树舌后菌丝生物量均保持在1.017～1.19 g/100 mL之间，结果无显著变化，这与王旭彤利用SA诱导暴马桑黄的实验结果一致。Liu Rui等在灵芝中发现SA抑制线粒体复合物III从而增加ROS生成，与对照相比，SA诱导下胞内MDA、SOD、CAT水平显著上升，表明SA同样能够提高树舌菌丝ROS含量。

植物受到环境波动影响，体内会产生两种主要类型的ROS作为副产物，当分子氧（O2）获得能量时，其产生单线态氧（1O2），当O2获得电子时，其变成超氧阴离子（O2-）。如SA可通过调节ROS积累降低高盐度对拟南芥萌发的抑制作用，通过激活青蒿中内源性ROS的爆发从而促进青蒿素的产生。在前人针对SA诱导其他大型真菌三萜生物合成机制的基础上，本研究进一步探索SA处理树舌菌丝后萜类生物合成途径中代谢物数量的变化，发现在SA诱导下倍半萜、单萜、二萜、三萜类代谢物数量增加。同时，通过分析萜类骨架生物合成途径和倍半萜类和三萜类生物合成途径，发现上调化合物法尼醇是树舌萜类物质合成中重要前体物质。Zhang Guang等在灵芝三萜生物合成的APSES转录因子GlSwi6的功能分析中发现，ROS参与调控鲨烯合成酶基因表达，当ROS含量上升时，鲨烯合成酶基因表达量上升，三萜含量也随之上升。本实验通过热图分析发现ROS与法尼醇等7 种萜类上调化合物紧密联系，而法尼醇与鲨烯同为合成三萜的前体物质，推测SA诱导下ROS参与调控合成法尼醇的倍半萜合成酶基因的表达，这在今后实验中需进一步验证。本研究中，树舌菌丝经外源SA处理，其ROS含量和三萜积累均呈现上升，表明SA可能通过调节ROS含量进而提高参与合成法尼醇的倍半萜合成酶基因表达量，最终使三萜含量增加。

本文《水杨酸对树舌菌丝三萜合成及活性氧含量的影响》来源于《食品科学》2025年46卷03期，作者：郭培洁，王占斌，夏永桥，王兴沛。DOI：10.7506/spkx1002-6630-20240415-147。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：彤禾；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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