Mol Cell | 线粒体富马酸抑制PINK1-Parkin介导的线粒体自噬

撰文 | 风

线粒体自噬（mitophagy）是一种选择性清除损伤线粒体的自噬过程，也是线粒体质量控制的重要机制。线粒体自噬的异常与多种疾病有关，例如神经退行性疾病、心血管疾病、衰老和肿瘤等。PINK1/Parkin是调节线粒体自噬的重要通路（详见BioArt报道：；； ）。PINK1是一种丝/苏氨酸激酶，定位在线粒体。在正常线粒体，PINK1通过TOM/TIM复合体持续转移到线粒体内膜（inner mitochondrial membrane， IMM ）（详见BioArt报道： ）。然而，在损伤线粒体中，膜电位去极化阻止PINK1向IMM转移，导致PINK1在线粒体外膜（outer mitochondrial membrane， OMM ）堆积【1,2】。随后，PINK1自激活并募集且磷酸化Parkin的65位点丝氨酸，引起后者活化【3】。作为一种E3泛素连接酶，Parkin促进多种线粒体蛋白的泛素化，导致募集多种自噬相关蛋白，例如p62、OPTN、NDP52和NBR1等，引起线粒体自噬和损伤线粒体的清除【4,5】。

延胡索酸（fumurate）也称为富马酸，是三羧酸循环的代谢产物。富马酸可以与蛋白质的亲核半胱氨酸残基通过Michael加成反应形成S-（2-琥珀酰）半胱氨酸（2SC）参与蛋白的琥珀酸化修饰【6】。在失能线粒体中，富马酸的增加会引起2SC的增加。2SC被认为是线粒体活性和氧化应激的生物标志并与多种疾病关联，例如糖尿病和肥胖等【7-9】。然而，富马酸介导的琥珀酸化是否参与线粒体自噬调节仍不清楚。

202 5 年 6 月 11 日 ， 韩国首尔国立大学分子生物学与遗传学研究所 Jongkyeong Chung 团队 在 Moleccular Cell 杂志 上发表了 题为 Mitochondrial fumarate inhibits Parkin-mediated mitophagy 的 研究文章 。 该研究揭示Parkin的323和451半胱氨酸位点的琥珀酰化抑制其线粒体定位和E3连接酶活性，进而阻碍PINK1-Parkin介导的线粒体自噬，提示富马酸作为PINK1-Parkin的内源性抑制剂参与线粒体稳态 。

前期文献报道糖代谢影响线粒体自噬。为了揭示其中细节，作者构建mito-Keima荧光报告（pH敏感）线粒体293T细胞筛选体系（CCCP诱导线粒体自噬）以区分正常线粒体和与自噬体融合的线粒体。随后，作者在上述293T细胞中逐一敲除糖酵解和三羧酸循环的关键酶，发现延胡索酸水合酶（FH）缺失显著抑制线粒体自噬，而同时敲减富马酸生成酶琥珀酸脱氢酶（SDHD）可以恢复减低的线粒体自噬。添加富马酸类似物也可以有效抑制CCCP引起的线粒体自噬。这些结果表明 三羧酸循环来源的富马酸可以抑制线粒体自噬。 为了验证富马酸介导的线粒体自噬抑制是否是PINK1-Parkin依赖的，作者在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中敲除PINK1和Parkin并发现富马酸对线粒体自噬的抑制作用仅在细胞存在PINK1和Parkin时生效。此外，富马酸可以直接抑制CCCP介导的Parkin线粒体转位。总之， 富马酸选择性抑制PINK1-Parkin通路介导的线粒体自噬。

考虑到FH存在线粒体和胞内定位，作者发现无论哪种定位，FH都可以促进线粒体自噬，提示细胞线粒体和胞内存在富马酸运输机制。此外，富马酸也可以来源于尿素循环和嘌呤代谢，为了检测是否其他代谢来源的富马酸可以影响线粒体自噬，作者发现敲减精氨琥珀酸裂解酶（ASL）和腺苷酸琥珀酸裂解酶（ADSL）而非SDHD，并不能恢复FH敲减引起的线粒体自噬抑制和Parkin的线粒体转位抑制，表明 线粒体SDHD和FH调节的富马酸参与线粒体自噬。 由于Parkin定位在胞质和线粒体外膜而富马酸产自于线粒体，线粒体来源的富马酸必须到达胞质才能调节Parkin。因此，作者猜测线粒体膜孔蛋白可能调节富马酸的转运，例如VDACs、SLC25A1、ANT1和SLC10A1。敲减VDAC1/2和ANT1而非VDAC3、SLC25A1和SLC10A1可以恢复FH敲减引起的线粒体自噬抑制和Parkin转位抑制。VDAC1/2和ANT1抑制可以有效降低胞内富马酸水平。因此， VDAC1/2和ANT1影响富马酸调节的线粒体自噬。

为了进一步研究富马酸的调节机制，作者使用2SC抗体检测Parkin的琥珀酰修饰，发现富马酸显著增加Parkin的琥珀酰化。Pull-down联合质谱和突变实验证实Parkin蛋白的323号和451号半胱氨酸位点发生琥珀酰化修饰。功能学实验检测发现Parkin蛋白的323号和451号琥珀酰化修饰阻止其与磷酸化泛素蛋白结合并抑制线粒体转位和E3泛素连接酶功能。然而，序列比对发现人Parkin的323号和451号半胱氨酸并不保守，例如果蝇和线虫。尽管如此，空间预测显示果蝇的344号酪氨酸（Y）和469号苏氨酸（T）位点与人Parkin的323号和451号半胱氨酸（C）相对应。随后，作者研究Parkin的323号和451号半胱氨酸位点的作用细节，结果发现323号半胱氨酸的琥珀酰化抑制其与磷酸化泛素蛋白结合，而451号半胱氨酸的琥珀酰化破坏底物结合。总之，这些结果表明 富马酸通过Parkin的323号和451号半胱氨酸位点的琥珀酰化修饰影响其活性调节线粒体自噬。

最后，作者在果蝇中发现FH和SDHD干扰分别增加和抑制头部富马酸水平，且FH干扰促进果蝇头部蛋白琥珀酰水平。为了在体内观察其效应，作者构建Y344和T469位点替换为C的parkin YCTC 敲入小鼠，发现其存活率降低，且表现出神经退行性病变，如受损的运动能力和多巴胺神经元数量降低。 parkin YCTC 敲入果蝇喂养富马酸加重神经退行性病变。然而，敲除SDHD和VDAC可以缓解 parkin YCTC 敲入果蝇的神经退行性病变。总之， 这些结果表明 富马酸调节的Parkin琥珀酰修饰在果蝇神经退行性病变中发挥重要作用。

综上所述，这 项 研究 揭示线粒体三羧酸循环来源的富马酸代谢物通过parkin蛋白323和451位点的半胱氨酸位点琥珀酰修饰抑制其线粒体转位和E3泛素连接酶活性，进而抑制PINK1-Parkin介导的线粒体自噬，为线粒体活动和神经退行性疾病的复杂作用提供新的见解。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2025.05.021

制版人： 十一

参考文献

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