Cancer Cell丨靶向IL-15R信号传导来增强NK细胞的抗肿瘤免疫

撰文丨章台柳

细胞毒性淋巴细胞（如自然杀伤细胞 NK 和 CD 8+ T 细胞）的活性是肿瘤免疫的核心。 CD 8+ T 细胞活性受到抑制性受体的调控，使用免疫检查点抑制剂（ ICIs ）阻断这些受体 - 配体互作可显著提升肿瘤患者的预后。其中 NK 细胞通过间接诱导肿瘤炎症，也可提升 ICIs 的效果。 NK 细胞在检测和清除转移灶方面起主导作用，它们能识别与 MHC-I 缺失和应激配体上调相关的细胞转化。 既然 NK 细胞在癌症预后中具有重要作用，那么对 调控 NK 抗肿瘤功能的重要通路 进行深入探究是非常必要的。

NK 细胞、恒定 T 细胞和传统 CD8⁺ T 细胞的功能都依赖细胞因子 IL-15 ，上皮 / 基质细胞表达的 I L -15 处于维持淋巴细胞稳态所需的低水平。抗原呈递细胞会急剧上调 IL-15 的产生，以在炎症（包括肿瘤微环境内）期间增强细胞毒性免疫细胞的启动、分化和效应功能。癌细胞也会产生 IL-15 ， IL-15 功能缺失突变与结直肠癌（ CRC ）更高的复发风险和更低的生存率相关。 IL-15 受体（由 IL-2Rβ/CD122 和 IL-2Rγ/CD132 组成）激动 剂 诱导酪氨酸磷酸化（ pY ）并激活 JAK1/3 ，进而激活 STAT5 并使其转位至细胞核，驱动促进细胞存活、增殖和效应功能 相关 的基因转录。给小鼠或非人灵长类动物注射重组 IL-15 ，会导致 NK 和 CD8⁺ T 细胞增殖并增强效应功能。然而， IL - 15R 激动剂 具有全身性毒性，限制其 在临床 的应用。 因此， 急需 开发在肿瘤部位具有活性偏向的 IL-15R 激动剂，或增强免疫细胞对局部 IL-15 水平升高反应的新策略 。

然而， IL -15 信号的调控机制目前尚不完全清楚。 SOCS 等负调控因子会被诱导产生，限制细胞因子信号的传导。 SOCS 1 可抑制 CD 8+ T 细胞中的 IL -15 信号传导，通过其 激酶抑制区（ KIR ）与底物结合槽相互作用，直接抑制 JAK 活性 ，而 OTUB1 被认为可负向调控 IL-15 诱导的 AKT 活性。 之前的研究 发现，细胞因子诱导的含 SH2 结构域蛋白（ CISH/CIS ），而非 SOCS1 ，限制了 NK 细胞中的 IL-15R 信号传导，在人类或小鼠 NK 细胞中敲除 CISH / Cish 会导致 IL-15R 反应过度，并增强抗肿瘤活性【1】。 然而， CISH 缺乏 KIR ，也不会直接抑制 JAK1/3 ，因此，开发用于免疫治疗的抑制剂药物颇具挑战，这也引发了关于 CISH 如何从机制上抑制生理性 IL-15R 信号传导，以及该信号通路中是否存在更易 成药 的靶点等问题。

2 025 年 X 月 X 日 ， 来自 澳大利亚 莫纳什大学 的 Jai Rautela 和 Nicholas D. Huntington 团队 合作 在 C ancer C ell 杂 志上发表文章 Enhancing anti-tumor immunity of natural killer cells through targeting IL-15R signaling ，通过全基因组CRISPR筛选来寻找NK细胞中IL-15R信号传导的调控因子，发现泛素依赖的IL-15R降解是IL-15R信号传导的主要调控因素。关键靶点包括 NEDD8 E2 结合酶 UBE2F 、泛素 E3 连接酶 ARIH2 ，以及 Cullin-5 RING E3 连接酶（ CRL5 ）成员。 UBE2F 是 CUL5 的 Neddylation 修饰和激活所必需的，而 ARIH2 促进 CRL5 介导的 IL-15Rβ 降解。敲除 ARIH2 或 UBE2F 会增加 IL-15Rβ 的表面表达并增强信号传导，导致促炎细胞因子产生，增强天然和嵌合抗原受体（ CAR ） NK 介导的细胞毒性。在缺乏 Arih2 、 Rnf7 或 Ube2f 的小鼠中， IL- 15R 高反应性 NK 细胞在体内对原发性和转移性肿瘤表现出更强的抗肿瘤免疫。因此， UBE2F 和 ARIH2 这两种酶 或是潜在 的免疫治疗药物靶点。

多种人类肿瘤中 IL -15 和 IL -15 RA 的表达水平升高，且存在表达 IL 2 RB/G 的免疫细胞，因此肿瘤微环境中 IL -15 R 信号传导呈现增强，或与免疫活性改善相关。且在多种人类肿瘤类型中， 如结肠腺癌（ COAD ）、肾上腺皮质癌（ ACC ）、子宫癌肉瘤（ UCS ）和皮肤恶性黑色素瘤（ SKCM ）， IL-15 表达水平与患者生存预后相关 。研究人员猜想， 与全身性 IL-15R 激动剂（会激活外周 IL-15R⁺ 免疫细胞，导致毒性）不同，破坏那些在炎症部位（如肿瘤）被诱导产生 且 负向调控 IL-15R 信号传导的通路，是增强局部 IL-15R 依赖性肿瘤免疫的更安全方法。 因此，在人类 NK 92 细胞中进行无偏倚的全基因组 CRISPR 筛选。结果显示，在低浓度 IL -15 （模拟生理状态下的 IL -15 浓度）下，所有 4 个 sgRNA 都显著富集的基因，涉及 CRL5 活性和靶向泛素化。这些基因包括 UBE2F 、 RNF7 、 ARIH2 、 CUL5 、 DCUN1D3 ，以及 SOCS 盒底物受体和已知的 IL-15R 调控因子 CISH ，证明敲除这些基因可增强 NK 细胞的存活、增殖 。在外周血 NK 细胞中进行亚文库 CRIPSR 筛选同样富集出 针对 UBE2F 、 ARIH2 、 CUL5 、 DCUN1D3 和 CISH 的 sgRNA ，进一步证实它们作为免疫治疗靶点的潜力。

随后，研究人员对筛选的结果进行验证。敲除 UBE2F 、 ARIH2 、 CUL5 、 RNF 7 、 DCUN1D3 和 CISH 显著增加 NK 细胞表面的 IL -15 R 水平，最高可达两倍，产生 IFNγ 和 TNF-α 的水平显著升高，且激活性受体 NKp 30 和 NKG 2 D 上调，抑制性受体 NKG 2 A 下调。即敲除这些基因可正向调控 IL -15 R 表达及其下游信号传导。鉴于 ARIH2 和 UBE2F 在免疫细胞功能中的作用在很大程度上尚不明确；因此， 研究人员 对在 I L -15 中培养的、敲除 ARIH2 或 UBE2F 的人类 NK 细胞进行了 RNA-seq 。与对照组相比，敲除 ARIH2 或 UBE2F 的 NK 细胞中， IL-2/STAT5 信号通路、 mTORC1 信号通路、糖酵解和氧化磷酸化，以及 MYC 和 E2F 靶向的标志性基因特征均上调 。 并且， 敲除 UBE2F 或 ARIH2 增强 NK 细胞的细胞毒性和对免疫抑制的抗性 。这表明通过消除 IL -15 R 的负调控来增强 NK 细胞对 IL -15 的反应性，能够克服 NK 细胞耗竭 / 功能失调以及免疫抑制等问题，这两者被认为是癌症患者中 NK 细胞抗肿瘤活性的障碍。 此外，在对天然 NK 抵抗或敏感的肿瘤细胞进行体外杀伤实验，结果显示在 CAR - NK 中敲除 UBE2F 、 RNF7 、 CUL5 或 CISH 能够 显著增强对肿瘤细胞的杀伤作用， IFNγ 产生显著增强。即调控 IL-15R 表达 / 信号传导 或增强 CAR-NK 细胞对慢性暴露于肿瘤细胞介导的耗竭 / 功能失调 的抵抗 。

UBE 2 F 和 ARIH 2 的缺失导致 NK 细胞转录组发生变化，但编码 IL -15 R （ IL15RA 、 IL2RG 和 IL2RB ）的基因未改变，这表明蛋白质稳态可能受到干扰。 对 IL -15 R 的亚基 CD 122 进行定量化分析，发现 CUL5 缺失对 CD122 的影响最大（ ~1.8 倍增加），其次是 UBE2F （ ~1.7X ）、 CISH （ ~1.6X ）、 RNF7 （ ~1.6X ）和 ARIH2 （ ~1.4X ），而 DCUN1D3 缺失的影响较小（ ~1.2X ） 。 IL -15 R 与配体结合诱导 STAT 5 和 AKT 的磷酸化， pSTAT 5 会诱导 CISH ，而 CISH 对蛋白酶体介导的降解非常敏感。进一步研究发现， ARIH2 和 UBE2F 是 CISH 降解以及 CISH 作为 CRL5 复合物底物受体的主要成分所必需的。 虽然 CUL 5 的表达在 ARIH2 和 UBE2F 敲除 NK 细胞中没有变化，但 UBE2F 敲除导致其主要表达一种较低分子量的形式。鉴于 UBE 2 F 是 E 2 NEDD 8 连接酶，这种低分子量代表着没有 neddylation 修饰的形式。 IL -15 R 信号导致 UBE 2 F 依赖性 CUL 5 的 neddylation 修饰。即 UBE 2 F 和 ARIH 2 在 CRL 5 复合物的激活中具有直接作用，以及它们对 IL -15 R 的降解具有绝对必要性。

最后，研究人员使用 sgRNA 构建基因敲除 NK 细胞并回输构建嵌合体小鼠，或是构建 NK 细胞特异性敲除小鼠在体内验证 Arih2 、 Ube2f 和 Rnf7 对 NK 细胞的调控作用。结果显示， Arih2 、 Ube2f 或 Rnf7 敲除 导致小鼠脾脏、肝脏以及循环 NK 细胞比例显著升高，且 NK 细胞表面 CD 122 水平升高，在体外对 IL -15 的增殖反应也增强。表明 Arih2 、 Ube2f 或 Rnf7 缺失在体内 / 外维持了 IL-15R 的表达和信号传导，意味着敲除这些基因可增强抗肿瘤免疫。 使用对 NK 细胞敏感的 B 16 F 10 进行肺转移模型构建， Arih2 、 Ube2f 或 Rnf7 缺失 显著减少肺转移灶。使用 MHC -1 缺陷型 MC 38 结肠癌细胞系构建肿瘤模型， Ube2f 或 Rnf7 缺失的小鼠显示出更强的肿瘤控制能力。表明 UBE2F/ARIH2/CRL5 复合物对 IL-15R 的降解，是 NK 细胞效应功能和肿瘤免疫中一个强大的抑制性检查点， 且 UBE2F 和 ARIH2 或 是肿瘤免疫药物研发的新型治疗靶点。

总的来说， 这项研究揭示了E2酶UBE2F和非典型E3连接酶ARIH2，对于激活CRL5复合物以及通过蛋白酶体降解来抑制IL-15R信号传导至关重要。CRL5复合物中任何成员缺失，都会增强IL-15R的表达、信号传导和效应功能，最终在体内增强抗肿瘤免疫。

制版人： 十一

参考文献

1. Delconte, R.B., Kolesnik, T.B., Dagley, L.F., Rautela, J., Shi, W., Putz, E. M., Stannard, K., Zhang, J.-G., Teh, C., Firth, M., et al. (2016). CIS is a potent checkpoint in NK cell–mediated tumor immunity.Nat. Immunol.17, 816–824.

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