江苏
一、原位杂交技术的定义与科学价值
原位杂交组织（细胞）化学（In Situ Hybridization, ISH）是基于核酸碱基互补配对原则，利用标记核酸探针与组织细胞内靶核酸（DNA/RNA）特异性结合，通过可视化检测系统实现核酸原位定位的分子病理学技术。该技术可对基因表达进行定性、定位及定量分析，尤其在低丰度 mRNA 与罕见基因表达分析中具有不可替代的优势，已成为分子生物学与病理学交叉领域的核心技术之一。
二、原位杂交的分类
根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类，其稳定性依次增大。
根据探针的标记物是否具有放射性，原位杂交又可分为同位素标记探针法和非同位素标记探针法两类。同位素标记探针法是用放射性同位素标记探针与靶核酸进行杂交，杂交后可用敏感性高的放射自显影技术检测。常用的放射性同位素如3H、32P、35S、125I等。非同位素标记探针法一般用半抗原标记探针，如生物素（Biotin）、地高辛素（DIG）等，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交最初是以同位素标记探针进行的，这种方法敏感性高，但核素具有半衰期限制、放射性污染且该方法成本高、耗时长，对实验人员具有辐射危害。而非同位素标记探针虽然在敏感性方面不如同位素标记探针，但其稳定性和分辨力高，检测时间短，一般在24h即可得到结果，同时操作简便，没有放射性污染的安全问题。因此，非同位素标记探针(尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针)迅速发展，逐渐成为原位杂交技术的主流方法，更受科技工作者的关注与青睐。
三、原位杂交选择指南
1、生物素标记探针or地高辛标记探针?
地高辛标记技术源于一种从洋地黄类植物中提取的类固醇物质——Digoxigenin（DIG）。由于Digoxigenin在自然界中来源单一，因此抗DIG的抗体不会与其他的生物物质结合，从而可以满足特异性标记的需要。同样是小分子标记物，生物素广泛存在于各种组织中，对于灵敏度很高的标记检测实验来说，样品自身含有的内源生物素，就会对结果产生干扰。地高辛就能够很好地避免这个问题。
2、PCR法or随机引物法?
如果有足够量的高纯度模板，可以采用随机引物标记方法。而当只能获得有限量模板，或模板仅仅部分纯化，或模板非常短时，PCR标记是制备DIG标记探针的优选方法。它比其他方法需要更少的优化，且标记探针产量高。在PCR标记过程中，热稳定聚合酶会在扩增模板DNA特定区域时结合DIG-dUTP。其生成的是高度标记、非常特异、且非常敏感的杂交探针。
市场上主要使用随机引物法的试剂盒如罗氏的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I 和II，标记效率较高；主要使用PCR法的试剂盒如常州百代生物的BIOG地高辛标记试剂盒，盒内特别的采用了超级热启动Taq酶，大幅提升了探针的杂交活性，与随机引物法相比，具有非常显著的性能优势，可以通过杂交检测到极低拷贝甚至是单拷贝基因。
3、地高辛标记的探针免疫酶学检测方法Dig –HRPor Dig –AKP？
常用的免疫酶学检测方法有两类：
·Dig –HRP（辣根过氧化物酶）检测体系：以DAB（四氢氯化二氨基联苯胺）/H2O2为底物，结果为棕色；或以4-氯-1-萘酚/H2O2为底物，结果为蓝色。
·Dig –AKP（碱性磷酸酶）检测体系：以BCIP/NBT为底物，结果为蓝紫色沉淀。
与免疫细胞化学方法相似，如应用酶促反应会较单一信号的标记物如荧光素具有更高的灵敏度。同样是酶促化学反应，AKP灵敏度和分辨率较HRP高约10倍左右。以BIOG地高辛标记探针原位杂交检测小鼠肝脏组织汉坦病毒感染为例（图1），以碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，与组织细胞中通过原位杂交定位结合的地高辛标记探针高效结合，再通过NBT/BCIP显色，即可灵敏准确地展示出所要检测的靶基因及其细胞定位，可广泛用于组织原位杂交、细胞原位杂交和染色体原位杂交等。
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