单克隆抗体的稳定性测试

摘要：单克隆抗体本质上是蛋白质性的，容易受到不稳定性问题的影响。单克隆抗体的稳定性测试是其作为治疗性生物分子开发和商业化的关键监管要求。本文回顾了众多的药物制造过程，例如：上游加工、下游纯化和无菌灌装以及物理和化学因素，例如蛋白质浓度、结构 、 pH 值、温度、光、搅拌、脱酰胺、氧化、糖化导致单克隆抗体的不稳定性 ，并重点介绍了用于研究和生成稳定性研究信息的各种分析技术，此后，有助于开发稳定性指示方法。此外，本文旨在讨论生物制品稳定性评估的 ICH 监管指南（ DS 原料药和 DP 药品）。

【第一】物理不稳定途径

1.1变性

抗体变性涉及高级结构（HOS）的丢失或通过铰链区与抗体的Fc结构域相连的2个Fab臂的展开来破坏二级和三级结构。抗体的去折叠和变性可能由多种环境因素触发，例如：温度升高（热量）、温度降低、pH值或化学不稳定性。Vermeer和Norde展示了一个2步展开过程，其中IgG分子中的Fab和Fc结构域彼此独立地变性，Fab结构域在61℃时的熔解转变和Fc结构域的熔解转变分别在71℃时通过差示扫描量热法（DSC）进行了研究。IgG样品冷却后，形成不可逆的聚集门，表明整个变性过程的不可逆性和抗体功能因暴露于高温而永久失效。数据还表明，热诱导的变性会影响Fab转导，而极端pH值（pH-3.5）诱导变性并影响Fc转导，这表明抗体的不同片段对不同的环境情况敏感。此外，温度升高导致IgG样品中二级一致性的变化，a-螺旋和无规则卷曲的增加，但b折叠和b转角的降低表明热变性对抗体二级结构的影响。通常，高温会诱导抗体中氨基酸的化学修饰、折叠中间体的聚集和未折叠状态的聚集导致蛋白质变性。熔解温度（Tm）是通过随着温度升高改变205nm远紫外CD光谱中的吸光度值来确定的。

Ogawa等人采用MALDI-TOF技术来确定化学修饰对骆驼科重链抗体（VHH）可变结构域中不可逆变性的影响。假设化学修饰（如脱酰胺化和异聚化）是抗体中的潜在降解机制，VHH抗体中的三个天冬酰胺（N）残基是上述修饰的热点，被丝氨酸（S）和苏氨酸（T）取代。MALDI-TOF数据表明，野生型中存在几个低分子量峰，当天冬酰胺被替换时，这些峰在突变型中被消除。此外，DSC结果显示，突变型在Tm=68℃下具有更高的热动力学稳定性，而野生型表现出Tm=65℃，表明化学修饰对VHH抗体中热诱导变性的影响。

1.2聚集体

由于物理不稳定性，聚集是在单克隆抗体中观察到的最普遍问题，也是生物制药行业普遍关注的问题。聚集是一种现象，涉及未折叠的天然蛋白或蛋白质片段自缔合成高分子量结构，例如二聚体、四聚体、低聚物，甚至亚微米或微米大小的颗粒。通常，由于存在多个表位和降低治疗活性，原蛋白聚集体增加了免疫原性潜力（患者的免疫反应）。考虑到从安全性和治疗的角度来看，聚集性门的形成是一个问题，监管指南限制了成品中10um至6000个颗粒/容器和25um至600个颗粒/容器的不可见颗粒（颗粒）的数量。此外，研究表明，相对于10um和25um粒径的颗粒，成品中存在0.1–10um范围内的不可见颗粒的百分比更大，这解决了我们理解重要浓度产品和产品质量评估的空间。硅油通常用作润滑剂，以实现塞子在用于药物输送的预装注射器（PFS）中沿桶平稳滑动。由于硅油与液体制剂接触，它有可能从设备脱落到溶液中，从而形成可见度以下的颗粒。硅油液滴通常落在1-25um的范围内，但也可能存在于<1um的范围内。

Krayukhina及其同事研究了注射器材料和硅油润滑对阿巴接受和阿达木单抗样品在不同缓冲液中聚集的影响（注射器在轨道摇床中以500发/分钟的速度摇晃）。微流成像（MFI）数据显示，在PBS配制的阿巴西普中，无硅玻璃和聚合物注射器中的颗粒计数相似，与硅润滑注射器相比，颗粒计数较低。在醋酸阿巴西普缓冲液制剂中，与无硅玻璃和聚合物注射器相比，在硅润滑玻璃注射器中观察到更多的颗粒（>1.0um）。两种阿达木单抗制剂的无硅玻璃和聚合物注射器的颗粒计数相似，而用于PBS制剂的硅油润滑注射器的颗粒计数更高。对于在醋酸盐缓冲液中配制的阿达木单抗，硅油润滑注射器中的颗粒计数高于任何其他注射器，硅润滑玻璃注射器中的颗粒计数最高，这表明蛋白质对玻璃表面的吸附比聚合物表面更强。

总体而言，本研究的结果表明，在无硅玻璃和聚合物注射器中未观察到颗粒计数的显着差异，并且与无硅注射器相比，硅润滑注射器的颗粒计数更高。这一发现表明，硅油润滑增加了蛋白质在表面的吸附，和/或加速了形成层的破坏，从而导致颗粒形成。

研究报告称，变性是聚集的先决条件，因为蛋白质中疏水斑块的暴露导致蛋白质：极性氨基酸残基之间的蛋白质相互作用。部分或完全变性抗体的疏水区域暴露在极性结果中，导致抗体之间的非特异性相互作用并产生小聚集体，这些聚集体作为较大聚集体的细胞核。此外，包括非共价键（如静电相互作用、氢键、范德沃尔力和疏水相互作用）或共价键（如二硫键）在内的机械异性键会导致抗体中形成聚集体。聚集体分类包括可逆或不可逆、共价或非共价以及可溶性或不溶性聚集体。可逆聚集是蛋白质天然形式的固有特性，并且本质上是自互补的，天然蛋白质表面通过弱的非共价相互作用自缔合形成可逆寡聚体。贝伐珠单抗是一种单克隆抗体，在生理条件下形成可逆聚集体，主要通过疏水相互作用形成。在贝伐珠单抗中观察到的弱可逆自缔合可能是由于pH值变化引起的平衡转移引起的。共价聚集体门是通过单体之间的交联形成的，例如从游离巯基残基形成二硫键是共价聚集体的一个例子。另一方面，非共价聚集体主要基于电荷相互作用（或极性）形成。然而，由于性质较弱，它们对pH值等溶液条件敏感，并且通常是可逆的。可溶性聚集体肉眼不可见，本质上是可逆的。同时，不溶性聚集体是可见的，并通过0.22um过滤去除。

与相互作用力一样，抗体中的聚集也受到不同生物加工步骤中遇到的多种环境和作因素的影响，从细胞培养条件、下游纯化加工到最终填充作，最后是储存和运输。除了力之外，影响蛋白质聚集的其他因素已在下面的部分中讨论。

1.2.1上游加工（USP）

聚集是蛋白质生产中最突出的降解途径之一。选择正确的蛋白质表达系统、细胞培养基成分（半胱氨酸、谷胱甘肽、铜、甘油）和细胞培养条件（温度、pH值、渗透压水平、溶解氧）对于最大限度地减少分泌蛋白中的聚集并减轻治疗性抗体下游纯化的负担并提高工艺产量至关重要。在此表达过程中积累了大量蛋白质。然而，使用不合适的检测系统会导致抗体中两条重链（Hc）和两条轻链（Lc）折叠不当，并形成不溶性聚集体。此外，细胞培养基的选择和适当的细胞培养条件可以通过影响蛋白质折叠成天然构象的能力来影响蛋白质聚集。在内质网（ER）中形成二硫键对于蛋白质折叠至关重要，并且需要存在氧化环境才能形成键。在没有这种环境的情况下，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中报道的半胱氨酸（C）基团上的游离硫醇基团（-SH）可能导致蛋白质错误折叠和抗体不稳定。据报道，优化细胞培养基中硫酸铜（CuSO4）的浓度可促进二硫键形成并减少聚集。Chanderjian及其同事主导的一项研究表明，在CHO细胞系培养物中加入CuSO4（Cu2þ）并增加浓度，可将Fab区域中的游离硫醇降低10倍。

游离硫醇含量的降低归因于Cu2þ离子，Cu2þ离子充当氧化剂并驱动抗体Fab区域中二硫键的形成。未观察到对细胞活力、代谢和细胞生产力的不利影响。Gomez等人展示了培养温度条件对CHO细胞聚集体水平的影响。确定了细胞培养温度和聚集体水平之间的反比关系，其中在33℃时观察到聚集体水平比37℃时增加了4-12倍。33℃时聚集体水平的增加是由于Hc和Lc转录脚本水平增加，而ER机制有限，导致蛋白质错误折叠并最终形成聚集体。观察到的趋势与另一项研究一致，在该研究中，生物反应器温度升高导致与重组融合蛋白的聚集减少。Franco及其同事通过在不影响细胞增殖的情况下改变细胞培养阶段的pH值，以及通过增加NaCl溶液的渗透压（300-395mOsm/kg H2O），发现抗PSA单克隆抗体中聚集体形成的显著减少。当抗体的pI在6.1–6.5范围内时，细胞培养基中的pH值升高至7.5，这增加了负电荷，导致分子之间产生静电排斥并减少聚集体形成。然而，pH值的进一步升高并未显示纯度水平的任何增加，并导致蛋白质分泌减少或细胞死亡。同样，渗透压增加超过340mOsm/kg H2O会导致过多的细胞应激，从而导致细胞死亡增加。

1.2.2收获后纯化/下游纯化（DSP）

为了实现单克隆抗体的高纯度并去除：宿主细胞蛋白酶（HCP）、宿主细胞DNA（HCD）、内毒素、细胞培养添加剂和产品相关杂质（聚集体、片段、脱酰胺和氧化物质）。细胞培养基中分泌的治疗性蛋白质经过各种色谱单元作，这通常称为下游纯化过程。此外，下游工艺能够进行病毒清除，以确保产品安全。

蛋白A亲和层析是下游纯化中的选择性捕获步骤，它利用抗体的Fc区与固定在柱状树脂上的蛋白A配体之间的特异性相互作用。将细胞培养上清液在中性pH值下加载到蛋白A柱上，然后在低pH条件下洗脱。在Campath-1H（Alemtuzumab）蛋白A亲和纯化中，用0.1M柠檬酸钠（pH3.2）进行低pH值洗脱，导致蛋白A池含有25%的聚集体，因此，表明洗脱缓冲液的pH值会影响蛋白A洗脱液的质量。Ejima及其同事报道了蛋白A洗脱缓冲液组分对洗脱抗体中回收率和聚集体形成的影响。研究结果表明，在pH值为4.3的0.5–2M精氨酸或其衍生物存在下，IgG1和IgG4很容易洗脱，这是由于精氨酸的作用下发生了盐渍化。

在存在其他氨基酸（例如：洗脱液中的赖氨酸、组氨酸、脯氨酸和甘氨酸）的情况下，未观察到相当的蛋白质A洗脱回收率。由于变性剂盐酸胍（Gdn HCl）与精氨酸共享胍基团以及有效的盐渍，因此作者研究了Gdn HCl的洗脱回收率。尽管Gdn HCl显示出良好的回收率，但洗脱的蛋白质池显示出由Gdn HCl的变性效应导致的广泛聚集。下游工艺中的后续色谱步骤，也称为精纯步骤，包括阴离子交换色谱（AEX）、阳离子交换色谱（CEX）和疏水相互作用色谱（HIC）。这些精纯步骤的目的是减少工艺和产品相关的杂质，例如：蛋白A浸出液、剪辑、高分子量聚集体和宿主细胞蛋白酶。使用廉价的离子交换树脂（如CEX或AEX）已证明蛋白质纯度为99.5%，聚集体水平为5%。DSP的最后一步是超滤/分离（UF/DF）步骤，通常也称为密流过滤（TFF）。此步骤的目的是使用过滤膜进行缓冲液交换并增加溶液中的蛋白质浓度。UF/DF在低温、低压或无化学添加剂等温和条件下运行，以最大限度地减少蛋白质产物的降解或变性。在一项研究中，超滤步骤的可行性是将单体与聚集体分离，通过评估单体在单克隆抗体100kDa PES、100kDa PVDF和300kDa PES中的三种过滤膜的传输来评估。还评估了将单体与聚集栅分离的pH值和离子强度。与其他两种膜相比，100kDa PES膜显示出非常低的单体转移百分比，这可能是由于在相同的pH值和盐浓度下阿仑单抗的高污染可能性。

在100kDa PES和300kDa PES膜中，未观察到搅拌速度对单体和二聚体的分离产生实质性影响。该工作的模拟结果表明，在UF/DF步骤中使用100kDa PVDF膜可以获得纯度为93.3%且产量大于95%的阿仑单抗单体。通过采用两级分离步骤可以提高纯度。

1.2.3配方、灌装和完成操作

考虑到配方和填充是生物制造过程的最后一步，不涉及进一步的纯化步骤。确保以最少/不形成聚集体的方式保持抗体稳定性变得至关重要。据报道，混匀、泵送、过滤和无菌灌装等灌装作会导致抗体变性和聚集。此外，确保用于合成的散装物质和成品药与灌装/成品加工过程中使用的材料以及与最终容器密封系统和给药装置兼容也至关重要。过滤器的结构材料和过滤器的尺寸可能会影响聚山梨酯20或聚山梨酯80等赋形剂的损失，并影响产品流动或降低过滤速率。Mahler等已经证明，聚山梨酯的吸附是抗体制剂中必不可少的稳定剂，这取决于无菌加工过程中使用的过滤器类型，并且还表明来自不同供应商的相同过滤器具有不同的蛋白质吸附速率。因此，选择除菌级过滤器至关重要，有必要分析赋形剂对最终过滤器（除菌过滤器）的吸附，以确保最终浓度在可接受范围内，并且对产品质量没有显着影响。此外，原料药对剪切应力敏感，应努力保持尽可能温和的泵送和混合活性，以防止聚集体形成并扰乱抗体一致性。在向原料药中添加赋形剂过程中混合不充分会导致溶液中的异质性，泵送会将外源颗粒引入溶液中，从而触发聚集。在灌装过程中，药品会与初级容器（小瓶和预装注射器）和其他组件（如塞子和柱塞）接触，这些组件会导致蛋白质聚集并影响产品质量。必须分析最终样品以评估对商品质量属性的影响。

1.2.4蛋白质浓度

高抗体浓度会增加蛋白质的聚集倾向（自缔合），增加溶液的粘度，导致蛋白质溶解性差，导致药物溶液难以通过注射器，并限制了工艺和灌装设备中的流动。此外，配制药物中聚集体的存在有可能降低患者的效力并增强患者的免疫原性反应。这种基于集中的聚集增加是真正的决定，因为与稀释的配方相比，高浓度的mAb优于皮下输送，因为注射量小，这需要开发高蛋白浓度的形式。Harn等采用特殊拓扑方法（CD、DSC、FTIR和荧光）的组合来研究两种高浓度单克隆抗体的物理结构和热稳定性或聚集趋势。用于研究三级结构的荧光光谱复制数据显示，随着抗体浓度的增加，热稳定性（λmax排放）降低。相反，用于探测二级结构的DSC和CD热实验结果显示，随着抗体浓度的增加，热稳定性略有增加。远紫外CD数据显示218nm处的负最小值表明抗体中存在高度的β折叠结构。本研究中热稳定性降低的可能原因可能是由于分子在高浓度下的聚集或自缔合。FTIR结果显示，在高浓度下，1615cm1和1690cm1附近的峰发生偏移，这与免疫球蛋白中的分子间β折叠结构相对应。自缔合对溶液粘度有很大影响，尤其是在低离子强度下，并且主要由带电电阻的静电相互作用和蛋白质表面的偶极子力介导。

另一项研究表明，由于偶极-偶极相互作用的优势，高浓度单克隆抗体的自缔合或聚集门控行为在其等电点（pI）附近最高，最终导致pI处的粘度更高。

1.2.5蛋白质结构

抗体的聚集倾向可以通过蛋白质中的不同结构水平来确定，例如一级序列（氨基酸序列，-NHCO-NH-CO-）、二级结构（a-螺旋和b-折叠）和三级构象。研究发现，抗体结构中最可变的区域，称为高可变区或互补决定区（CDR），容易与商业抗体中的Fc结构域一起聚集，这表明介导抗原反应的相同肽环也介导抗体聚集。研究报道，在特定的CDR中插入带电氨基酸残基有助于最大限度地减少聚集。研究人员观察到，在阿尔茨海默病淀粉样蛋白b-肽特异性抗体的单域（VH）内对CDR3进行工程化处理，可以抑制聚集，但不包含结合亲和力。通过在两个边缘（N端和C端）插入两个或多个带负电荷的氨基酸残基（Asp-Asp和Asp-Glu-Asp）或在一侧插入带电的残基突变CDR3，并将突变插入靠近CDR3的疏水部分。CDR3带电变体显示出与母体相似的二级结构和构象稳定性，并且另外预先通风的热诱导聚集，即使在非CDR环中引入5个带电残基时也没有观察到这一点。

研究结果表明，在疏水性CDR的边缘引入带电残基可能是防止自缔合或聚集的有效策略。抗体的三级结构是根据氨基酸残基侧链基团的折叠决定的，有利于相互作用（静电键、疏水键和氢键）和展开有利于相互作用（静电排斥），以达到稳定状态（或最低能量状态）。蛋氨酸残基在抗体Fc结构域的结构稳定性及其生物学功能中起重要作用。在一项研究中，通过将人IgG1Fc结构在0.3%H2O2中孵育，然后通过远紫外和近紫外圆二色谱（CD）和动态扫描热量测定（DSC）进行二级和三级结构分析，对两个保守的蛋氨酸残基（CH2结构域的Met33和CH3结构域的Met209）进行强制氧化。CD数据显示甲氧九个残基的氧化导致Fc结构域的二级（远紫外）和三级（近紫外结构）发生扰动。与CD数据一致，DSC数据表明热稳定性降低，氧化时CH2结构域的Tm变化较大，而CH3结构域的Tm变化较小。

在同一项研究中，对照样品和氧化样品的SEC分析表明，在45℃避光条件下在3cm3玻璃瓶中孵育长达28天的氧化样品中，聚集率为50%，而对照样品的聚集体形成率低于1%。这项工作的结果证明了抗体结构中甲硫氨酸氧化对蛋白质稳定性的影响，需要在抗体的制造和储存过程中对甲硫氨酸九氧化进行严格监测和控制。

Lacob及其同事研究了两种不同IgG1单克隆抗体（mAb1和mAb2）的高阶结构及其聚集形式，例如使用氢氘交换质谱仪（H/DX-MS）和其他生物物理技术（如SEC和SDS-PAGE）（R和NR）的二聚体。本研究中分离和研究的二聚体是在生产、纯化和储存过程中自然形成的。起始mAb1和mAb2样品的SEC分析显示，二聚体占1-3%，分析超速离心机（AUC）证实了这一点。通过SEC对混合单体和二聚体进行再分析，显示单体含量为98%，而mAb1和mAb2中的二聚体含量分别为96%和94%纯度。对SEC收集的单体和二聚体组分进行非还原性SDS-PAGE分析，发现mAb1和mAb2的二聚体种类之间存在显著差异。mAb2二聚体群体是异质性的，在300kDa处观察到最丰富的条带，而mAb1二聚体观察到单个150kDa条带，在300kDa处观察到轻微的微弱条带。还原SDS-PAGE分析表明存在HC和LC条带，mAb2中的二聚体通过二硫键连接。采用H/DX-MS技术根据蛋白质构象差异的位置收集信息。H/DX-MS的工作原理是蛋白质中某些氢原子（例如酰胺氢（-NH）与氘原子）交换的原则，然后进行质谱仪检测，其中在分子中，交换发生在蛋白质、肽或氨基酸水平。H/DX-MS分析可以通过测量氘吸收（质量摄取）随时间变化的相对量，将对照样品与分析物定量比较。

在本研究中，通过在室温下将mAb1和mAb2的单体和二聚体在15倍100mM磷酸钠、200mM NaCl（pD6.8）D2O缓冲液中稀释来进行氘标记。对于每个时间点（10秒至4小时），用等体积的淬灭缓冲液[4MGn HCl、200mM磷酸盐缓冲液、0.5M TCEP（三（2-羧乙基）膦，H2O]将pH值调节至2.5，以淬灭交换反应。使用固定化胃蛋白酶柱2.1mm *30mm（15℃，30秒）消解样品，使用含有1.7um颗粒的C18BEH（Waters Corp.）分离消解样品，0.1℃时平均背压为8800psi。对于mAb1和mAb2，分析了总共123种和141种肽段的H/DX-MS数据。在mAb的重链和轻链中，单体和二聚体之间的氘掺入没有观察到差异。相比之下，在mAb2中，大多数肽在单体和二聚体中显示出相同的氘代摄取，但连接Fc-CH1和Fc-CH2结构域的铰链区以及抗体本身的Fc-CH2结构域除外。肽206-242对单体和二聚体的氘化量不同。在D2O暴露10秒后，单体比二聚体更氘化，表明二聚体采用阻止交换发生的构象。mAb2二聚体中的大多数这些残基被限制在铰链区的218-242个。肽206-242的氘吸收曲线表明该区域不是很灵活，并且受到溶剂的影响，如与氘的低氢原子交换所示，这与之前发表的点燃反应一致。在Fc-CH2结构域中249-259个残基之间的重叠肽中也观察到类似的差异。然而，在较长的孵育期（>1min）中，摄取减少，这可能是由于蛋白质的灵活性和未暴露的残基暴露于氘交换。这项工作的结果表明，考虑到氘摄取，mAb1和mAb2单体和二聚体物种的构象异质性是不同的。mAb2具有完整的铰链区，单体和二聚体之间的H/DX存在差异。

1.2.6温度（包括冻融过程）

众所周知，由于干扰条件，药物制造、储存和运输过程中的温度变化（高温和低温）可能会通过展开或部分展开抗体的Fab和Fc结构域来诱导单克隆抗体中的聚集。高温诱导IgG变性，导致不可逆的聚集体形成和形成变化。据信，低温会诱导蛋白质聚集，因为低温会减少疏水相互作用，这是有利于蛋白质折叠的主要力量之一，导致抗体的疏水区域暴露于溶剂中，分子间疏水相互作用增加，导致其聚集。与低温密切相关，冻融过程可能是一种破坏性应力，可通过聚集影响抗体的稳定性，而聚集是降解的主要途径。在冷冻过程中，蛋白质与气液界面或容器表面接触（吸附到容器表面），导致蛋白质部分展开并随后聚集。此外，由于冷冻过程中缓冲液结晶，制剂缓冲液的pH值降低，使溶液暴露在酸性环境中，这可能导致构象变化和聚集。此外，冻融循环过程中的升温和降温速率、多次冻融循环、冻融中使用的容器材料和几何形状都会改变蛋白质稳定性并导致聚集体形成。

Haweand同事证明了冻融和热应力产生的聚集体的显著结构差异。除ATR-FTIR分析外，通过将无应力样品暴露于74℃维持10min的热应力下，并对未应力样品进行5次重复冻融循环来创建应力样品。为了产生足够数量的颗粒用于FTIR分析，对于热应力样品，将无应力样品在77℃下加热15分钟，对于冻融应力样品进行25次冻融循环。从紫外光谱、DLS和光遮蔽方法获得的定量数据显示，在冻融胁迫中，相对于无胁迫样本，热胁迫样本中，亚可见粒子的数量显著增加（表1）。在实验中，SEC结果表明冻融应力对聚集体形成的影响很小（0.2%），而热应力样品表明聚集体（11.9%）和二聚体（4.5%）的比例很大（表1）。在热应激样品的非还原条件下，SDS-PAGE中可以看到一条大聚集体带。然而，条带在还原条件下消失，表明聚集体通过二硫键连接，本质上是共价的。定量方法的结果表明，热应激样品产生了尺寸相对较小的聚集栅，这些栅极通过二硫键共价连接，但与聚集体尺寸较大的冻融样品相比，聚集体的百分比很高。远紫外CD和近紫外CD光谱检测到热应力样品中的显著结构变化和冻融样品中的边际变化（表1）。通过ATR-FTIR光谱进行的结构表征表明，随着分子间β折叠形成的增加，热应力样品的结构发生了变化，但冻融25次循环后冻融应激样品仍然类似于未应力样品的FTIR光谱（表1）。这项工作的结果表明，热应激和冻融诱导的单克隆抗体样品在聚集门形成和结构变化方面表现出显着差异，这些发现可能有助于开发具有低免疫原性潜力的高质量IgG制剂。

表1.热应激和冻融应激对单克隆抗体聚集体的理化表征

1.2.7 PH值

众所周知，单克隆抗体的聚集速率受pH值的强烈影响。抗体生产过程中的下游纯化步骤包括改变pH值和缓冲液成分，以便从柱填料中结合和洗脱蛋白质。在低pH条件下，蛋白A中心和抗体上的组蛋白基团带正电荷，导致静电排斥和蛋白A-IgG疏水相互作用的减弱，从而导致与单克隆抗体和融合蛋白聚集。Arosio及其同事研究了三种单克隆抗体（两种IgG1和一种IgG2）在酸性条件（低pH值）下的聚集机制和稳定性行为。将IgG2样品在25mM柠檬酸缓冲液和0.15M Na2SO4中孵育6小时，以获得不同的pH值和温度值，并通过SEC方法分析。本研究结果表明，样品在4℃、pH4.5和4.0下具有稳定性，而在25℃、pH3-4.4和4℃、pH3.0下观察到可溶性低聚物的形成，在37℃、pH3.0下形成高分子量聚集体（可溶性微米）。为了研究长期稳定性，将先前的少数样品在类似条件下孵育15小时。样品随时间变化的DLS分析显示，Z平均水动力半径范围从几到150nm，最初缓慢、线性增加，导致孵育12小时后，样品在37℃、pH3.0下大量聚集，然后在15小时后快速加速形成视觉不溶性聚集体。在相同条件下，用两种IgG1（IgG1.1和IgG1.2）重复相同的分析。SEC数据显示，IgG1.1在pH3.0、37℃下形成亚微米聚集体，IgG1.2在pH3.0、25℃和pH3.0、37℃下分别形成不溶性聚集体，而DSC数据显示IgG1.1寡聚化步骤最初与IgG2相似，但速度较慢，但一旦达到IgG1.1寡聚体的临界浓度，相对于IgG2，较大聚集体的形成发生在更快的动力学中。另一方面，在本研究中，与IgG1.1和IgG2相比，IgG1.2表现出更快的寡聚化速率和更快的聚集动力学。

从这项工作中可以得出的一般结论是，低pH条件会促进免疫球蛋白中的聚集/寡聚化，并降低抗体稳定性，这是由于Fc片段中CH2结构域对酸性条件的敏感性，以及低pH值诱导的聚集，这与已发表的文献一致。另一项研究发现，当人源化单克隆抗体LA298在5℃和25℃的柠檬酸盐缓冲液中孵育8周和37℃1周时，在不同pH和温度下蛋白质浓度没有显着变化。在不同的pH条件下，使用其他缓冲液（磷酸盐、琥珀酸盐和酒石酸盐）也获得了类似的结果。通过SEC分析进行pH值对聚集的影响。除磷酸盐缓冲液外，缓冲液的其余部分在储存过程中随时间推移的聚集量可忽略不计。磷酸盐缓冲液（pH6.5）中的抗体在6周内在5℃和25℃时聚合物峰增加，表明磷酸盐缓冲液中的聚集趋势最高。在5℃下，在pH值为4.0至7.0的柠檬酸盐缓冲液中，未观察到对单体水平的影响，但是，在相同的pH条件下，在25℃下，单体水平下降了11%。由于在相同条件下柠檬酸盐缓冲液的聚合物水平没有变化，并且单体损失可归因于样品中片段的形成。使用琥珀酸盐和酒石酸盐缓冲液观察到类似的效果。

然而，磷酸盐缓冲液显示单体水平降低，在25℃时pH值从6.5增加到7.0。这些结果表明，抗体中的单体损失可能与pH值（包括高pH条件）、温度和缓冲条件有关，应仔细优化和选择上述参数以进行抗体储存。

1.2.8光

全球的药品监管机构已经认识到光对蛋白质的损害，并要求各行业评估光降解对蛋白质产品质量的影响。来自国际协调会议的ICH Q1B指南指出，光照测试应是压力测试的一个组成部分，并应证明光照不会导致不可接受的变化。有关根据法规指南执行光应力测试的详细信息已在本文的第4节中讨论。单克隆抗体从生产过程开始，从运送到诊所/医院和患者给药的过程开始，在许多点都暴露在光线下。在下游纯化过程中，抗体暴露在检测器的紫外可见光下，这会导致抗体降解，药物制造过程中的其他潜在光源包括填充、目视检查、标签、包装、长期储存、在诊所/医院去除初级包装、稀释和静脉注射袋，其中产品暴露在光线下一段时间，也可能影响药物的稳定性。蛋白质中光降解的主要靶标包括色氨酸（Trp，W）、酪氨酸（Tyr，Y）、苯丙氨酸（Phe，F）、半胱氨酸（Cys，C）、胱氨酸和组氨酸（H），它们在光照下吸收能量并在更高水平上被激发，激发的分子将能量转移到氧上，从而形成活性单线态氧原子，氧化相应的氨基酸。除氧化外，常见的光降解途径是聚集，这通常是由于酪氨酸自由基的交联而发生的，酪氨酸自由基是酪氨酸光降解副产物的前体。

Mason及其同事研究了pH值和光照对IgG1抗链霉亲和素单克隆抗体聚集和构象的影响。在10mM乙酸钠（pH3.5和pH5.0）和10mM磷酸钠（pH8.0）中制备0.1mg/ml和10mg/mL样品，并在302nm光下暴露不同的时间点。选择302nm波长进行研究是因为除了色氨酸外，其他发色团在该波长下都没有显著吸收，并且在此波长下没有酪氨酸吸收。对暴露于302nm光下不同时间点（0-60分钟）的样品进行的SEC分析表明，与pH3.5和pH5.0相比，pH8.0下的聚集体形成速率更高，在早期洗脱峰的增长和主峰展宽方面。这表明光解过程中聚集体的形成与pH值有关。此外，1mg/mL和10mg/mL样品暴露于302nm光下60分钟的SEC-MALS分析显示，在所有pH值下都形成了二聚体，此外，在pH值为5.0时观察到三聚体，而在pH值为8.5时观察到四聚体和较大的聚集体。与SEC数据一致，SDS-PAGE降低表明随着pH值的增加和凝胶中重链条带上方暴露时间的增加，形成了高分子量条带物质（或聚集体）。还观察到低分子量剪切的物质，其分子量低于轻链和轻链，表明光暴露会导致抗体片段化。为了研究光对构象的影响，通过DSC评估热稳定性，采用远紫外CD和FTIR方法进行二级结构分析，采用近紫外CD和内禀色氨酸荧光法进行三级结构分析。在DSC中，由于Fab和CH2结构域的去折叠，分配了第一个熔解转换（或大的去折叠转换峰），然后是由于CH3结构域的去折叠而分配了小峰。

DSC数据表明，瞬态温度峰值向较高温度转变，pH值升高表示pH值降低，Tm降低，这意味着热力学稳定性降低，聚集性增加。DSC结果还显示，所有pH值的去折叠转变均变宽，表明形成去折叠中间体。然而，展开是不可逆的，可能是因为聚集体的形成。色氨酸荧光对环境极性高度敏感，随着疏水性的增加，可以看到其发射光谱向较低波长的偏移（蓝移）。在三种不同的pH条件下，使用0.1mg/mL、1mg/mL和10mg/mL的样品进行本征荧光，加热后发射荧光，然后在302nm处曝光，30min用于研究构象稳定性。数据显示，最终Fmax随着pH值的增加而降低，pH值为3.5时为348nm，pH值为5时为346nm，pH值为8.0时为343nm。1mg/mL和10mg/mL暴露于302nm光下60min的近紫外CD分析显示，在pH3.5和pH8.0下，1mg/mL的光谱变化，但没有在所有研究的pH值下，观察到10mg/mL浓度的显著变化。

远紫外CD数据表明，在215-220nm之间观察到的峰随着pH值为3.5的暴露时间增加而变得更加负向，而在1mg/mL和10mg/mL下，pH值为5.0和pH8.0的暴露时间增加，相同的峰值变得更加正向。在215和220nm之间观察到的负峰变化表明b折叠结构发生变化，阳性趋势表示b折叠构象的丢失和无规则线圈的增加。FTIR研究表明抗体浓度没有影响，但是，在1660至1680cm1区域（pH值为3.5）中几乎没有观察到额外的条带，该区域被分配给二级结构中的转弯，并且在1615cm1处观察到一个额外的条带，这通常被认为与分子间b折叠结构有关。在10mM乙酸钠（pH5.0）和10mM磷酸钠（pH8.0）下，未观察到暴露样品与未暴露样品的二级结构发生重大变化。与聚集体随着pH值（pH8.0>pH5.0>pH3.5）的增加而增加的聚集体相反，与pH5.0和pH8.0相比，在pH3.5时>pH5.0>pH8.0）。抗体构象的变化可能是由于氨基酸侧链的质子化导致天然结构重组为新的结构，即相对紧凑且聚集潜力较小的A状态。总体而言，这项研究表明，聚集和一致性与pH值呈负相关，聚集依赖于pH值，但不是构象，必须采取预防措施来保护抗体免受光照不稳定的影响。

Bane等进行了光稳定性研究，研究了ICH光照条件（1.2106luxh的可见光和200瓦时/m2的近紫外光）对IgG1（在论文中称为mAb1）、模型肽/野生肽和突变肽的影响。突变肽是Trp被Ala残基取代的模型肽。除了在ICH条件下进行光刺激分析外，所有肽均暴露于k1/4254nm 30min。胰蛋白酶后消化（37°C持续5小时）和MS分析显示抗体的Fc区存在两种His保留肽（His293-HC和His318-HC）。与对照样品（未暴露在光线下）相比，提取的离子色谱图（XIC）和MS/MS谱图显示光辐照的His-293HC和His-318-HC肽分别增加了48Da和32Da，并表明存在双氧化和三氧化组氨酸残基。两种肽的His氧化产物在主峰后洗脱，这可能是由于构象差异导致His pKa值降低和去质子化。此外，两种含His的肽中都存在Trp，这可能是促进样品中额外氧化反应的原因，这在以前已经报道过。在k1/4254nm处光照射的模型肽（W285wt和W321wt）的MS/MS表征在光照射的W285wt样品中除了将His转化为Asn（0.5%）和Asp（0.4%）外，没有显示明显的His氧化，而光照射的W321wt肽、His到Asn（0.2%）和Asp（0.4%）产物的小百分比以及单氧化His（0.1%）观察到。该数据与mAb1MS/MS数据一致，其中观察到His氧化率较低。在两种野生型肽中观察到显著水平的Trp氧化产物（>10%）。

在突变肽（W285A和W321A）的情况下，除了His氧化产物外，没有观察到其他降解产物。W321A肽的XIC导致氧化产物在7.6min（m/z1412.76）内洗脱，比对照肽（未辐照肽）重48Da，证实存在三重氧化His残基。W321A的MS/MS谱图数据证实了XIC结果，因为b4和y8-17离子相对于对照肽增加了48Da。在ICH条件下进行光照射后，突变肽（W285A和W321A，不存在Trp）未光降解，但野生型肽（W285wt和W321wt，含有Trp的肽）导致氧化产物的形成，相对于天然肽，产量分别为0.8-7.1%和0.6-49.2%。这项研究的数据揭示了在不同光照条件下不同产品的形成，强调了光源、照射波长和蛋白质一级序列中相邻氨基酸残基存在的重要性。

1.2.9搅拌（摇晃和搅拌）

机械应力（如摇晃）是抗体在运输和处理过程中遇到的常见应力之一。众所周知，摇晃可以加快单克隆抗体聚集体形成的速度并诱导结构变化。Telikepalli及其同事研究了不同环境应力的影响，包括在0.15MNaCl存在下的震动，并根据形态表征了聚集体和颗粒，颗粒数量和结构改变。通过以300rpm的转速搅拌mAb1-3天来制备振荡应力样品。与未应力样品相比，在用于分析数十纳米尺寸范围颗粒的SEC分析中，在振荡应力样品中未观察到无NaCl的物质变化。然而，在0.15M NaCl存在下，应力样品显示聚集体形成增加。微流数字成像（MFI）和目视检查表明，在存在NaCl的情况下会形成大的不可见颗粒（2-50um），在不存在和存在NaCl的情况下会形成可见光颗粒（>100um）。在同一研究中通过MFI进行的形态分析裂解表明，在存在NaCl的应力条件下，与在没有NaCl的情况下相比，颗粒似乎是透明和细长的。

使用FTIR的二级结构研究表明，在1635cm1和1692cm1处存在二级导数最小值，在应力样品中没有额外的峰。这项工作的结果揭示了震动应力对聚集体、颗粒形成及其形态的影响，并强调了制定策略以尽量减少它的必要性。另一项研究旨在深入了解单克隆抗体在5℃和25℃下摇动和搅拌两种搅拌方法下的聚集行为。通过将样品瓶水平放置在水平振动板上，避免阳光直射，以200rpm产生振荡应力，而将样品瓶垂直放置在多位置磁力搅拌器上，避免阳光直射，从而在200rpm时产生搅拌应力。使用10mg/mL IgG1抗体进行时程研究，具有不同聚山梨酯-20（PS-20）浓度0、0.0025、0.005、0.01、0.02和0.05%。样品在5℃和25℃下通过以各种填充体积（2.5、5.3和9.0ml/6mLvial）摇动和搅拌进行应激。在振荡应力168小时后，具有顶部空间的PS-20游离样品显示：可见颗粒、可溶性聚集体、平均粒径、乳光和2um亚可见颗粒的数量增加，无论温度条件如何。然而，在25℃下，10um颗粒的数量显着增加，并且在相同温度下，尺寸为25um的颗粒和浊度没有观察到应力诱导的变化。

在5℃和25℃的相同条件下，搅拌应力样品显示2um和10um亚可见颗粒的可见颗粒、浊度和数量显著增加，超过了检测上限（18000个颗粒/mL），表明搅拌是一种苛刻的应力方法，据报道会导致：搅拌棒/玻璃底部之间或抗体与疏水性特氟龙涂层搅拌棒之间的剪切、界面间应力效应，空化和局部热效应。对于使用不同PS-20配方在两种温度下顶空振荡应力样品，样品不含可见颗粒，浊度、可溶性聚集门、2um和10um颗粒以及聚集门显着降低或预防。搅拌应力样品表明，在较高浓度（0.05%）下添加PS-20后，浊度和10um和25um大小的颗粒降低，这表明聚山梨酯具有保护蛋白质免受搅拌应力的潜力，尽管在更高的水平上，这可能是由于摇动和搅拌是两种不同的应力机制。然而，即使在高多糖酸盐浓度（0.05%）和两种温度下，也观察到可见颗粒和2um粒径颗粒的增加。在填充体积为2.5和5.3ml/6ml的小瓶中，无聚山梨酯配方在摇动下表现出浊度、可见部分和可溶性聚集体的增加，而在样品瓶中没有顶部空间（填充至最大）的情况下摇动样品，则显示压力样品没有变化。另一方面，在5℃下填充体积为2.5和5.3ml，PS-20含量低至0.005%的振荡应力样品显示出聚集体、浊度、可见颗粒和亚可见颗粒的减少，其方式与没有顶部空间和无PS-20的样品类似。在25℃下，填充体积为2.5ml的0.0025%PS-20的降解样品产生高分子量物质。样品瓶中没有顶部空间，可防止液体样品在振荡过程中旋转和飞溅，从而抑制液体样品对气液界面的吸附和蛋白质内在结构的展开，从而导致聚集体的形成。总体而言，本研究的数据揭示了摇动与搅拌应力产生的聚集体种类的差异，以及摇动或搅拌时抗体容器内的顶部空间、聚山梨酯和填充体积的影响。

AUC是超速离心机与光学监测系统的组合，可以实时监测样品沉积物分布。SV-AUC以高速进行，导致样品从转子中心沉降，并在样品池底部（称为样品池）产生沉淀。SV-AUC中的数据以吸光度与径向距离的关系表示，其中线的平坦化发生在样品的沉降中，并有助于确定沉降系数[S]。沉降速度-分析型超中心离心法（SV-AUC）是一种强大的分析工具，用于定量抗体聚集体，通常用作尺寸排阻色谱（SEC）的正交方法。考虑到与SEC相关的问题，例如蛋白质吸附到固液界面上导致蛋白质单体和聚集体定量不准确、柱筛板过滤聚集体以及流动相和产品配方组成的差异，生物制药行业正在采用AUC来研究蛋白质聚集体。在AUC中，不涉及基质（无蛋白质吸附），并且可以在原始蛋白质配方中分析聚集体含量。

Krayukhina及其同事已经证明，使用SV-AUC和SEC对不同人免疫球蛋白获得的聚集测量结果具有良好的一致性。此外，当使用高斯略脂法而不是垂直滴法对色谱结果进行积分时，一致性程度更高，这表明不同积分方法在结果定量解释中发挥着关键作用。Gandhi等对静脉注射免疫球蛋白（IVIg）制剂进行搅拌应激（室温下20rpm，持续0、90、180和270min），并通过SEC和SV-AUC分析样本。使用不同盐浓度（0.2M磷酸盐缓冲液）进行SEC分析，范围为0至400mM NaCl。与流动相中使用的400mM NaCl回收率（0mM NaCl时为89.4±0.5%，400mM NaCl时为99.1±0.6%）相比，0mM NaCl下未搅拌和搅拌样品的总蛋白质回收率较低。回收率的显著差异可能是由于NaCl抑制了蛋白质分子和二氧化硅基树脂之间的静电相互作用，从而阻止了非特异性蛋白质与树脂的结合。SV-AUC结果表明，与SEC相比，HMWs的解解效果更好，所有样品的单体峰沉降系数为6.2。SEC和SV-AUC均显示HMW在180分钟的搅动过程中增加，随后HMW减少，不溶性聚集体相应增加。SV-AUC中吸光度平台的降低随着样品搅拌过程中的增加而表明总可溶性蛋白的损失和不溶性聚集体的形成。在0、90、180和270分钟的搅拌下，连续沉积系数分布下面积的百分比减少（（c（s））为0.8±0.7%、0.4±0.2%、2.4±0.2%和8.8±0.6%，这可能与样品中存在的不溶性聚集体的水平有关。总体而言，在400mM NaCl下，SEC和SV-AUC的不溶性聚集栅和可溶性物质（HMW、二聚体和单体）的水平相当。然而，两种方法在较低的盐浓度下存在显著差异。由于SEC中完全回收至少需要400mM的NaCl，因此使用SV-AUC方法对于蛋白质单体、可溶性和非溶性聚集体的准确定量至关重要。此外，SV-AUC可用于检测和定量样品中存在的SEC分析无法分辨的蛋白质聚集体类型。然而，SV-AUC是一种昂贵的仪器，通量低（每天3-7次样品分析），并且需要大量培训才能操作。

1.2.10辅料

根据其稳定抗体的能力选择辅料是基于文学知识、经验和初步配方开发。聚山梨酯是单克隆抗体制剂中常用的赋形剂。聚山梨酯是两亲性非离子去污剂（表面活性剂），由聚氧乙炔酯的脂肪酸酯组成，作为稳定剂添加到抗体制剂中，以抑制表面诱导的蛋白质不稳定性，从而导致抗体构象的聚集和改变。研究报道，聚山梨酯80和20通过与玻璃表面的蛋白质竞争，通过与蛋白质表面的疏水区域结合来保护蛋白质，并且通过与部分折叠的蛋白质分子结合并抑制导致聚集的分子间相互作用，从而促进分子的重新折叠而不是其聚集，从而起到伴侣的作用。然而，有人担心，由于自氧化，聚山梨酯中存在的低水平过氧化物可能会诱导蛋白质的氧化降解，从而导致蛋白质不稳定。Agarkhed等研究了不同浓度（0.00、0.01、0.10和1.00%）的聚山梨酯80对热应激和光应激单克隆抗体IgG1样品的影响。通过将抗体在4°C、25°C、40°C和50°C下在黑暗条件下储存4周来制备热降解样品，而光降解样品则遵循ICHQ1B指南，将样品瓶保持在直立位置，在25°C的温度下，可见光总照明为1.2106勒克斯小时，近紫外光为200瓦时/平方米。单体百分比没有变化。对于在4℃下储存的PS-80浓度不同的样品进行观察。

然而，在25、40和50℃下储存的样品显示单体含量降低，尤其是在1%PS-80浓度下，这表明PS-80在较高浓度下暴露于高温时具有不稳定作用。在单体含量中未观察到PS-80对光胁迫样品的显着影响，三级结构（near-UVCD）表明即使在较高浓度下，polysorbate-80也不会显着影响蛋白质的光稳定性，这与文献中报道的数据一致。

宿主细胞蛋白（HCP）杂质会对人类患者产生抗基因作用，必须在下游纯化过程中去除，并在最终药品中降低到低水平。Chiu及其同事假设，由于聚山梨酯和甘油三酯之间的结构相似性，CHO HCP杂质（如脂蛋白脂肪酶（LPL））可能导致多糖酸酯降解，并影响mAb的稳定性。根据这一假设，作者研究了LPL对聚山梨酯降解的影响。LPL很难通过下游纯化去除，因为它在色谱图形填料精纯时表现出与mAb类似的产物缔合和保留特性。研究中应用靶向基因破坏技术以降低LPL表达，结果显示，与野生型相比，CHO-K1lpl敲除细胞系（使用CRISPR生成）中的聚山梨酯降解（PS-20和PS-80）减少了41%至57%，表明LPL对聚山梨酯降解的影响。

其他添加剂，如氨基酸、糖和酚醛，在蛋白质折叠和蛋白质制剂中经常使用，可抑制聚集并提高蛋白质稳定性。众所周知，精氨酸及其衍生物可以减少或防止光诱导聚集，增强热稳定性并增加蛋白质在不同单克隆抗体中的溶解度，使其成为抗体治疗剂型和色谱分离的潜在添加剂。组氨酸和蔗糖通常用作抗体制剂中的赋形剂。Baek和他的同事领导的一项研究研究了mAb制剂缓冲液中常用赋形剂（组氨酸和蔗糖）对流体动力学半径（RH）的影响，RH是聚集的指标。使用动态光散射（DLS）评估流体动力学半径，并通过OmniSIZE软件根据使用Stokes-Einstein方程的扩散系数测量值从平均信号中评估。这项工作的结果表明，组氨酸在制剂缓冲液中的作用显示流体动力学半径随浓度的变化而变化，并且在低组氨酸浓度（1-20mM）下未观察到聚集体的形成。在pH值为5.8时，流体动力学半径从5.1nm增加到6.4nm，浓度从1mM增加到10mM，这可能是由于mAb的运动与组氨酸中的小离子之间的耦合。然而，在相同的pH条件下，RH在10至40mM之间保持恒定，然后在60mM组氨酸浓度以上降至5.5nm。相反，在pH值为7.0时，RH（6.6至6.8nm）与组氨酸浓度无关，这可能是由于pH值增加，这降低了净正电荷并最大限度地减少了mAb和组氨酸离子运动之间的耦合。这种行为与以前的研究一致，这些研究显示，对于稳定的抗体制剂，随着组氨酸浓度的增加，聚集百分比降低。单独添加蔗糖或与组氨酸联合添加后，由于蔗糖与mAb结合导致水合层增加，导致水合层增加，并显示出组氨酸和蔗糖的累加效应，因此RH随蔗糖浓度增加而增加。

【第二】化学不稳定途径

在生物治疗药物行业中，已经表征了许多化学降解途径，包括脱酰胺和异构化、氧化、二硫键断裂、C端剪切和碎裂。其中许多已被证明可以诱导聚集并影响单克隆抗体的热力学稳定性、二级和三级构象。

2.1脱酰胺和异构化

脱酰胺是一种非酶促翻译后修饰，涉及在单克隆抗体中将天冬酰胺（N）和谷氨酰胺（Q）氨基酸残基转化为天冬酰胺酸（D）和谷氨酸（E）。天冬酰胺比谷氨酸更容易脱酰胺。脱酰胺作用受溶液的邻近氨基酸和pH值的影响很大。已发现肽C端甘氨酸（G）的存在会不稳定，并被认为是反应性（Asp-Gly）的热点。在中性和碱性pH值（pH>6）中，酰胺基团发生分子内环化并导致形成苏卡酰亚胺，苏卡酰亚胺是五元环中间体，不稳定，水解成两种降解产物的混合物——天冬氨酸和异酰胺酸，再加上Asp的异构化形成IsoAsp涉及由于额外甲基的运动而导致的骨架到侧链的重排。

在酸性pH值（pH<4）下，酰胺基团发生直接水解，导致仅产生单一产物天冬酰胺酸。2005年，Zheng等证明了缓冲液pH值、缓冲液类型和温度对单克隆抗体LA298重链中天冬酰胺（Asn55）dea化速率的影响。在柠檬酸盐缓冲液的情况下，储存过程中的脱酰胺速率在25℃下随着pH值（4.0-7.0）的增加而增加，用于单次和双重脱酰胺。另一方面，在37℃的低pH值（4.0–4.5）下，两种脱酰胺均未观察到脱酰胺，但在相同温度下，在较高pH值下观察到脱酰胺的显著增加，与相同pH条件下25℃下的脱酰胺速率相比，观察到脱酰胺的显著增加。在酒石酸盐和琥珀酸盐缓冲液中观察到类似的效果，而在37℃下，当pH值从6.5变为7.0时，磷酸盐缓冲液的单次脱酰胺率降低，并且获得的值与观察到的柠檬酸缓冲液的脱酰胺速率没有可比性。这项研究的结果表明，高pH值和高温会加速dea中化反应。由于更大的柔韧性和溶剂暴露，mAb中的互补决定区（CDR）容易发生脱酰胺和其他降解。Vlasak等人证明轻链（LC-Asn33，序列......N33GN35T...使用CEX分析，然后对胰蛋白酶消化轻链样品进行ESI-MS和MALDIMS分析，对人源化单克隆抗体IgG1的互补决定区1（CDR-1）。

从未降解和非脱酰胺（LCAsp33/Asn33）降解样品相比，从CEX分析中分离的IgG酸性变体组分（LC-Asp33/Asn33）和（LC-isoAsp33/Asn33）与抗原的结合活性降低。检测到的deami日期IgG1变体（LC-Asp33/Asn33）、A2（LC-isoAsp33/Asn33）和天然Fab组分在远紫外CD测定的二级结构中没有显示出显着差异。然而，近紫外CD数据显示，带有iso-Asp33的Fab片段的三级结构发生了亚级变化，椭圆度降低，这可能是由于芳香族残基和二硫化物周围微环境的影响。这项工作表明，CDR环中的脱酰胺对抗体的抗原结合活性和构象有显著影响。在一项类似的研究中，研究了单克隆抗体重链CDR2中Asp异构化对抗体结合活性的影响，并研究了pH和制剂缓冲液对异构化速率的影响。与脱酰胺化一样，异构化可能发生在天冬氨酸之后是甘氨酸的地方，但是，在异构化中未观察到氨基酸的电荷态或分子量发生变化。在单克隆抗体中，通常在高温和低pH值下观察到异构化。疏水作用色谱（HIC）技术用于IsoAsp与天然抗体的相对定量。IsoAsp单克隆抗体的结合分析显示与抗原的结合亲和力降低，40C下的强制降解研究表明，随着时间的推移，结合随着异构化内容的增加而降低。然而，未观察到其他降解途径，如聚集、碎裂和电荷异质性。为了观察不同制剂缓冲液对异构化的影响，将天然单克隆抗体与制剂缓冲液pH6、HPLC水、柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液pH5和琥珀酸盐缓冲液pH5在4℃、22℃和37℃混合，并通过HIC分析这些样品的异天冬氨酸含量。数据显示，在6周内，随着温度的升高，异构化增加，缓冲液也显示出对异构化速率的显着影响，因为相对于琥珀酸盐缓冲液pH5，柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液pH5中的异构化速度更快，表明缓冲液类型、离子强度和温度在异构化中起重要作用。

2.2氧化

氧化是蛋白质中经常发生的主要化学降解途径之一，其残基如蛋氨酸（M）、色黄素（W）、酪氨酸（Y）和半胱氨酸（C）。氧化受外在和内在因素的影响，例如自氧化或在存在每种氧化物（例如：过氧化氢）、轻和金属的情况下。考虑到甲硫氨酸氧化成蛋氨酸亚砜（MetO）通常在抗体的Fc区报道，Gao及其同事研究了单个蛋氨酸氧化（Met252、Met358和Met428）对人源化IgG1 mAb中通过定点诱变对Fc-FcRn结合的影响。向mAb样品中添加H2O2（0.01至0.1%）或叔丁基过氧化氢（t-BHP，0.5–5%），并在25℃避光条件下孵育样品不同时间点，从而引入强制氧化。

通过用谷氨酰胺（Q）突变感兴趣的蛋氨酸进行定点诱变的结果显示，氧化和突变的mAb之间的结合亲和力、热稳定性和蛋白A亲和力没有显著差异，这表明谷氨酰胺是评估单个蛋氨酸残基对FcRn结合影响的良好模拟工具。

来自蛋白A色谱、结合亲和测定和DSC分析的数据表明，与Met252相比，Met252残基对FcRn结合的影响更大，保留时间更短，Kd值增加，去折叠温度Tm降低。未观察到对Met358的MetA结合氧化、FcRn结合和稳定性的显著影响，表明Met358残基对FcRn结合的氧化影响最小。本研究产生的信息对于识别关键质量属性（CQA）和设定产品规格可能很有价值。在另一项研究中，研究人员调查了脱酰胺和氧化对抗体聚集、疏水性和顺应稳定性的影响。将mAb储备液在H2O2（最终蛋白质：H2O21：100）中于25℃下孵育1天，引入Met氧化反应，将样品在37℃下在2,20-氮氧化物（2-甲基丙酰脒）二羟氯化物（AAPH；2mg/mL）中孵育3天，使蛋白质：AAPH摩尔比达到1：100，从而产生Trp氧化反应。通过将mAb储备液与Tris碱（pH9.5）在37℃下无光孵育1周来实现脱酰胺。质谱分析显示，mAb1的Fab区和mAb2的Fc区均存在高水平的Met氧化，但mAb1和mAb2的Trp氧化仅在Fab区观察到。Asn-脱酰胺主要在PENNY肽（Fc区的脯氨酸谷氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺-酪氨酸）中观察到，在Fab区观察到最低水平。

来自SEC和DSC的数据表明，在低pH值和高pH条件下，<2h的孵育中，Trp氧化和脱酰胺样品具有高水平的多分散性和聚集体形成，而Met氧化样品与对照相似。在7-28天的延长储存期内，甲氧化样品在较高温度（37℃）和低pH条件下表现出高水平的聚集，但Trp氧化和脱酰胺样品在较高pH值（pH6.0和7.4）下表现出聚集体形成。聚集还促进了抗体的展开，降低了其折叠稳定性。为了评估聚集对mAb展开行为的影响，采用了DSC技术。DSC结果表明，与对照样品相比，在较宽的pH范围内观察到Met氧化样品的去折叠温度（Tm）降低，但对于Trp氧化和脱酰胺样品，Tm没有明显变化。HIC数据表明Trp氧化和脱酰胺样品中的疏水性增加，但Met氧化样品中的疏水性降低，这可能是自缔合和聚集水平低的原因。总体而言，本研究的结果表明，不同化学修饰对抗体构象稳定性、聚集行为和疏水性的影响之间几乎没有相关性，并强调需要评估不同化学修饰稳定性对抗体聚集行为、疏水性和构象稳定性的影响。

2.3二硫键形成、混乱和裂解

大多数获批的治疗性单克隆抗体归类为IgG1类别，由32个半胱氨酸残基组成，形成16个二硫键（12个链内键和4个链间键）。二硫键的形成是发生在细胞内的重要翻译后修饰，特别是在酶和伴侣存在下促进蛋白质正确折叠的内质网（ER）。然而，报告表明，存在低水平硫巯基（-SH）的单克隆抗体，抗体结构中这些不成对的半胱氨酸（C）残基（游离-SH基团）通常是二硫键形成的起始物种，并可能导致抗体聚集。不仅限于聚集，二硫键相对较低的解离能和铰链区的柔韧性还涉及与二硫键相关的许多其他化学修饰，例如：铰链区裂解、二硫键裂解/不完整二硫键形成、二硫键扰乱、半胱氨酸化、二聚化和三硫键形成。众所周知，轻链的可变结构域比恒定结构域具有更多的巯基（-SH），而重链的CH3结构域具有最多的巯基，其次是CH2，然后是CH1结构域，最后是可变结构域（VH）。抗体体内链间二硫键中存在的游离巯基数量最少，这很可能是由于二硫键形成不完全而发生的。不同抗体中游离SH基团数量的差异可能是由于生产过程的不同，例如使用不同的细胞系、细胞培养和纯化程序。

Lacy等使用CD仪器证明了IgG单克隆抗体的游离-SH含量与热稳定性之间的相关性。该实验在温和变性条件（5M盐酸胍和50℃）下进行，并在216nm处记录CD信号，温度升高1℃/min。这项研究的结果表明，在变性条件下，最不稳定的抗体的SH摩尔分数高于高熔点温度。

2.4糖基化

糖基化是一种非酶修饰，由蛋白质表面赖氨酸（K）残基的胺基与a还原糖（包括葡萄糖、半乳糖和果糖）的醛基反应产生。mAb的糖基化可能受多种因素的影响，例如哺乳动物细胞培养过程中糖料中的糖含量和种类、细胞培养过程中的温度和pH值。虽然配方中通常不存在还原糖，但制剂中常用的还原糖（如蔗糖）的降解可能会在抗体储存过程中引入糖基化。由于单克隆抗体的糖化速率通常非常低，因此在高温下将抗体与高浓度糖（如葡萄糖或蔗糖）一起孵育时进行强制降解研究（应激研究），以识别糖基化热点。硼酸盐亲和色谱成像（BAC）是一种常用的分离糖化和非糖化特异性物质的技术。在碱性条件下，色谱柱填料上的硼酸盐四面体阴离子官能团与糖分子上的顺式1,2-二醇阵列结合。非糖化物质较早洗脱，而糖化物质在梯度中洗脱较晚。将糖基化对抗体聚集的影响相关联的报告并不一致。Fisher等在500mM葡萄糖存在下孵育mAb（制剂缓冲液：240mM蔗糖，pH5.5），以检查糖基化对聚集的影响。

SEC和SDS-PAGE数据显示，糖化和非糖化抗体样本在聚集体或剪辑的形成方面没有显著差异，表明糖化对抗体中的聚集现象没有影响。与上述工作相反，Banks等证明了山梨醇和蔗糖等赋形剂对表达IgG1和IgG2单克隆抗体的CHO细胞在高温和2-8°C下的聚集速率（或高分子量物种的形成）的影响。本研究产生的数据表明，与4℃和29℃下不含赋形剂的制剂相比，用蔗糖或山梨醇配制的抗体在4℃和29℃下显示出较低的聚集率。然而，一段时间后，与山梨醇制剂相比，蔗糖制剂显示出高分子量物质的显著增加，这可能是由于蔗糖水解，并表明糖基化先于聚集。在37℃下储存的样品也观察到了相同的现象。为了证实糖基化对聚集的影响。在同一项研究中，另一种单克隆抗体（IgG2）与250mM葡萄糖和250mM山梨醇分别在37℃下孵育3个月。与非糖化对照（山梨醇制剂中的Ab）相比，与葡萄糖一起孵育的mAb样品表现出更快的聚集速率（大约三倍），这与第一个mAb的结果一致。

2.5外消旋作用

除甘氨酸外，所有氨基酸在带有侧链的碳上都是手性的，并受到碱催化的外消旋化。外消旋化是通过碱基去除a-甲嘧啶氢形成碳阴离子而发生的，然后产生D-对映异构体（或不可代谢的氨基酸形式）。Amano等人发现Cys220在40℃下储存6个月的IgG1中发生外消旋化。在重链上的铰链区序列S219CDKTHT225检测到外消旋修饰，并通过胰蛋白酶肽潮汐映射和质谱分析与Ca-氢/氘（H/D）交换结合来证实。Cys220在D2O中降解，允许在Cys220旁边的Asp221处同时形成异肽，这表明反应机制涉及碱催化，它激活Lys222的酰胺氮原子攻击Cys220的羰基碳形成咪唑酮环或Asp221的b-羧基形成琥珀酰亚胺。

【第三】稳定性监管指南

在药品开发过程中，稳定性是指满足与质量属性相关的预定义验收标准或规范。ICH Q5C指南提供了评估生物技术/生物产品原料药（DS）和药品（DP）稳定性时应遵循的系统方法的详细信息。稳定性研究的目的是评估DS或DP质量在不同环境因素的影响下，在一段时间内将受到怎样的影响，例如：温度、pH值、光、剪切和氧化。此外，通过各种已验证的物理、化学、生物、免疫化学和微生物分析测试，从至少三个生产批次（或中试工厂规模批次）的DS/DP生成的稳定性信息有助于建立适用于在类似情况下生产的所有后续批次的重新测试期。药品稳定性测试的设计基于原料药行为的知识和从原料药稳定性中得出的信息。

稳定性研究的执行应根据经批准的稳定性研究方案进行，该方案包括有关DS/DP稳定性评估、建议的储存条件、产品有效期、明确定义的规格和测试间隔的详细信息。对于原料药和药品，该指南推荐了三种稳定性测试研究：长期研究、加速研究和压力测试，这些研究必须在不同的储存条件下形成，并且在提交时需要不同的时间点数据（表2）。稳定性测试的长度应涵盖DS/DP的储存、运输、处理和后续使用。此外，DS/DP的整个稳定性研究应在由相同材料制成的容器中进行，并使用与制造相同的容器密封系统。以下内容描述了不同种类的稳定性研究以及执行这些研究的监管要求。

表2.DS和DP稳定性研究的监管要求

3.1长期稳定性研究

长期研究（通常也称为实时研究）涉及将测试样品（原料药或药品）储存在各自的储存条件下，以确定保质期或重新测试期（表2）。长期稳定性储存条件因原料药/药品在冰箱（20°C或以下）或冰箱（2-8°C）中的储存而异（表2）。长期稳定性研究的目的是根据研究生成的实时数据确定DS/DP的稳定性概况，并确定药物批准后的复试期（或保质期）。根据ICH Q5C指南，在提交数据时，需要至少3个DS/DP批次的6个月稳定性数据，并且应持续一段时间以涵盖建议的重新测试期。原液和双药的稳定性测试频率为第一年每3个月一次，第二年每6个月一次，第三年每年一次，随后根据保质期进行。用于监管提交的稳定性批次数据至少应以中试规模生产，采用与未来批次生产相同的工艺。

3.2加速稳定性研究

加速储存条件的目的是评估在产品储存、处理或运输过程中可能发生的短期偏差的影响，支持确定有效期的数据，生成可能有助于建立DS/DP降解曲线的信息，并协助分析方法的有效性。通常，加速稳定性研究在高温下进行，以加快产品在化学降解或对DS/DP样品的物理损害方面的分解速度。有时，加速稳定性研究生成的数据可能有助于在研究后的几个月内确定DS/DP的保质期。

3.3应力稳定性研究（通常也称为力退化研究）

DS/DP应力稳定性研究的目的是故意使样品降解，从而进行鉴定可能的降解产物，最终可能有助于建立产物降解途径，了解分子的内在稳定性和评估稳定性，表明样品测试中使用的分析程序的能力。应力测试包括研究温度（50℃或以上，以10℃为增量）、相对湿度（75%或更高）、pH值（pH值范围广）、光照和氧化对原料药的影响。

光测试是稳定性测试的一个组成部分，通常在DS和DP的单批次产品上进行。根据ICH Q1B指南，在光稳定性测试中，样品必须暴露在至少120万勒克斯小时的整体照明（可见光）和不低于200瓦时/平方米的紫外线下。此外，对照样品（称为暗控制）应包裹在铝箔中，并作为受压样品放置在条件/环境中，以评估直接比较并确定光诱导变化对样品的贡献。与其他应力研究一样，从光稳定性测试中获得的信息对于阐明降解途径的年代以及开发和验证相关分析方法很有价值。

3.4确定稳定性指示分析方法

稳定性指示法（SIP）是经过验证的方法，可用于检测原料药（DS）或药品（DP）在不同环境条件影响下一段时间内的稳定性，并监测稳定性研究的结果，以确保产品的安全性、有效性和质量。稳定性指示方法必须能够定量样品中存在的DS/DP和降解产物。应力稳定性研究（也称为力降解研究）通常用于鉴定降解产物，这进一步有助于确定分子的内在稳定性，建立产品的物理和化学降解途径，并开发DS/DP的稳定性指示方法。此外，力降解研究还可以帮助开发产品配方，并解决与稳定性相关的问题，因为这些研究可以在短时间内进行并了解产品的质量概况。在力降解研究期间形成无降解产物允许终止研究并表明分子的稳定性。然而，降解产物的产生和峰的变化可能有助于促进配方开发、储存条件和包装，因为在胁迫条件下形成的降解产物最有可能在实际储存条件下形成，这反过来又可用于提高稳定性，表明所采用的方法。

【第四】结论

单克隆抗体（MAb）是一类主要用作治疗剂的生物制药产品。MAb本质上是蛋白质，会经历各种物理和化学降解机制。物理不稳定性包括变性和聚集，而化学不稳定性包括：脱酰胺、异汞化、氧化、键改组。糖基化和二硫化物。

有多种物理和化学因素会影响产品的稳定性，并最终影响产品的安全性和质量，尤其是在集装箱封闭系统中长期储存 / 运输期间，例如：温度、光线、湿度和搅拌。因此，使用经过验证的分析方法评估和彻底调查 MAb 的物理化学和生物稳定性是一项监管要求，以便在以下方面全面表征 DS/DP ：降解产物的大小、电荷、鉴定和检测。

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