Genome Biol丨窦亚丽/刘一凡团队开发基于ipdTrimming的6mA足迹方法揭示了长距离核蛋白的异质性组成

表观遗传学的核心任务之一是绘制核小体和其他 DNA 结合蛋白在整个基因组中的分布 图谱 。 传统研究方法 ，如 DNase-seq、 MNase -seq、ATAC-seq以及CUT&RUN/CUT&Tag等【1-4】 ， 依赖DNase I、微球菌核酸酶（ MNase ）和Tn5转座酶等核酸酶的特异性切割技术 结合高通量测序手段，以实现DNA-蛋白质作用位点的解析 。这些方法 虽能识别单个结合位点 ，却存在一个局限：在DNA链切割过程中，同一DNA分子上不同核蛋白结合位点的空间关联信息会不可避免地丢失。

近日 ，南加州大学窦亚丽课题组与刘一凡课题组 联合 在 Genome Biology 杂志发表题为Revealing long-range heterogeneous organization of nucleoproteins with 6mAfootprintingbyipdTrimming的研究 论文 ， 本研究 通过腺嘌呤甲基转移酶对 哺乳动物基因组 上未受核蛋白保护的DNA 进行N6-甲基腺嘌呤（6mA）修饰而形成的足迹（6mA footprinting ） ，结合 PacBio 单分子实时测序（ PacBio SMRT Sequencing ,图1A ） 技术的读长优势，实现了对长链 DNA 分子上多个核蛋白结合位点的协同定位 ，揭示了长距离核蛋白的异质性组成。

单分子实时测序技术中，可通过读取 DNA 聚合酶跨越单个 DNA 碱基的脉冲间隔时间（ interpulse duration, IPD），并与未修饰对应序列背景下的碱基 IPD 值对比，实现单碱基分辨率的 6mA 检测。默认情况下，PacBio CCS 模块通过平均多轮单分子测序的 IPD 值，获取 DNA 双链每个碱基的 IPD 值。然而，实时测序中 DNA 聚合酶的随机停顿会引入异常偏大的 IPD 值，这些离群值可能显著干扰 CCS 模块生成的 IPD 值，导致 6mA 识别结果失真。

此前，我们通过整合 PacBio 的 ipdSummary 模块，通过全局调控异常 IPD 值以控制背景噪声，虽可实现高精度的 6mA 检测，但计算成本较高 [5] 。在此基础上，我们开发了一种大幅简化的计算流程 （ 此处 我们称之为 ipdTrimming ） ：在 IPD 转换过程中引入局部离群值修剪机制，即对每个位点先剔除最大的 IPD 值，再利用改良后的 CCS 模块对剩余 IPD 值进行平均化处理，生成 CCS IPD 值。经标准 化 转换后，将该值与嵌入相同局部序列中的未修饰对应 序列背景的 参考 IPD 值（即 kmer 模型）进行比对，通过计算所得的 IPD 比率（ IPDr ）实现 6mA 精准识别（图1B）。这一优化显著提升了检测效率，同时降低了计算资源消耗。

我们系统地将 ipdTrimming 与 ipdSummary 在 包含阳性对照（dam + 大肠杆菌质粒片段）、阴性对照（四膜虫全基因组扩增样本）、低甲基化（天然四膜虫基因组 DNA）和高甲基化（体外核小体阵列及人类染色质的 6mA 足迹）的四个基准数据集上 进行了比较，结果显示 ipdTrimming 在甲基化上检测的假阳性率和假阴性率与 ipdSummar y 流程相近， 但 在计算资源消耗方面却显著低于 ipdSummary（图1C-E）。

此外，我们将 ipdTrimming 流程整合到6mA足迹（6mA footprinting ）实验中，在 单分子水平上广泛绘制了核小体定位和转录因子结合图谱，揭示了转录相关表观遗传的关键特征。此外，我们 利用此流程 在线粒体 DNA 中建立了高分辨率的长距离结合事件，揭示了 其DNA复制过程中形成的独特置换环结构（D-loop）， 凸显了 6mA 足迹法在捕捉核蛋白协同结合 和 分辨率解析异质性表观遗传状态方面的潜力。

总体而言， ipdTrimming 流程为6mA检测建立了一个 高效的框架， 通过结合长读长单分子测序的6mA足迹实验 来深入了解不同生物学背景下的表观遗传事件 提供了一种变革型工具。

南加州大学 医学院 教授 窦亚丽与南加州大学 医学院 副教授 刘一凡为该论文通讯作者。南加州大学 博士后杨文涛为该文章第一作者 ， 南加州 大学 博士后 Xue Qing Wang ，博士生魏帆和已毕业硕士生 于婧绮 对本文亦有重要贡献。

https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-025-03592-9

制版人：十一

参考文献

1. Song L, Crawford GE: DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells.Cold Spring Harb Protoc2010, 2010: pdb prot5384.

2. Kaya-Okur HS, Wu SJ, Codomo CA, Pledger ES, Bryson TD, Henikoff JG, Ahmad K, Henikoff S: CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.Nat Commun2019, 10: 1930.

3. Zaret K: Micrococcal nuclease analysis of chromatin structure.Curr Protoc Mol Biol2005, Chapter 21: Unit 21. 21.

4. Buenrostro JD, Giresi PG, Zaba LC, Chang HY, Greenleaf WJ: Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.Nat Methods2013, 10: 1213-1218.

5. Sheng Y, Wang Y, Yang W, Wang XQ, Lu J, Pan B, Nan B, Liu Y, Ye F, Li C, et al: Semiconservative transmission of DNA N (6)-adenine methylation in a unicellular eukaryote.Genome Res2024, 34: 740-756.

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