孩子注意力不集中、情绪不稳怎么办？科学家揭示KOR拮抗逆转DAT功能异常机制

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异常的多巴胺（DA）信号传导与精神分裂症、双相情感障碍（BPD）、自闭症谱系障碍（ASD）、物质使用障碍以及注意力缺陷多动障碍（ADHD）密切相关。目前这些疾病的治疗仍不理想，例如ADHD常用的治疗药物右旋安非他命和哌甲酯具有高度成瘾风险。

基于此，2025年5月29日，佛罗里达大西洋大学Sammanda Ramamoorthy研究团队在Molecular Psychiatry杂志发表了“Kappa opioid receptor antagonism restores phosphorylation,trafficking and behavior induced by a disease-associated dopamine transporter variant”揭示了κ阿片受体拮抗恢复了一种疾病相关多巴胺转运体变异体所诱导的磷酸化、转运及行为改变。

为了寻找更安全、无成瘾性的治疗多巴胺相关疾病的新方法，作者使用了一种临床前小鼠模型，该模型表达一种在患有ADHD、ASD或BPD个体中发现的人源多巴胺转运体（DAT）编码变异体DAT Val559。DAT Val559与一些其他疾病相关的DAT变异体一样，表现出异常的多巴胺外排（ADE），这种效应可被右旋安非他命和哌甲酯所阻断。κ-阿片受体（KOR）在多巴胺神经元中表达并调控多巴胺的释放与清除，提示靶向KOR可能是一种调节因DAT功能异常而紊乱的多巴胺信号的替代策略。激活KOR可增强野生型DAT的细胞膜转运及其在Thr53位点的磷酸化，而这些效应在Val559突变体中表现为组成性激活。此外，在离体组织中，通过拮抗KOR可逆转DAT Val559引起的这些异常变化。更重要的是，KOR拮抗还可纠正DAT Val559小鼠体内多巴胺释放异常以及性别相关的异常行为。鉴于KOR拮抗剂具有较低的成瘾风险，作者的研究在一个具备结构有效性的多巴胺相关疾病动物模型中进一步支持将KOR拮抗作为一种药理学策略，用于治疗与多巴胺系统失调相关的大脑疾病。

图一 KOR激动剂U69,593通过依赖Thr53的机制增强DAT介导的多巴胺摄取

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为了评估通过调节KOR来抵消DAT依赖性DA稳态改变的策略，作者在EM4细胞中瞬时转染了编码KOR和DAT的大鼠cDNA（分别为rKOR和rDAT）。激活KOR以时间和浓度依赖的方式增强了DAT介导的多巴胺摄取，该效应可被KOR拮抗剂norBNI所阻断。选择使用10 µM U69,593预处理15分钟进行后续体外实验。结果显示，U69,593处理显著提高了多巴胺转运的最大速率（Vmax），而对多巴胺转运的米氏常数（KM）无明显影响。目前尚不清楚KOR是通过DAT中的哪些位点或结构域调控其功能的。已有研究表明，DAT的磷酸化是一种关键机制，决定了其活性及在细胞膜上的转运能力。由于有证据显示MAP激酶ERK1/2参与KOR对DAT的调控，并且DAT N端存在一个保守的、由脯氨酸定向激酶介导的含Thr53的磷酸化基序（该位点可被ERK1体外磷酸化），于是重点关注了DAT的N末端区域。该位点已被证实可在体内外影响DAT的功能。作者首先构建了两个N端缺失的rDAT突变体：Δ1-22（缺失前22个氨基酸）和Δ1-55（缺失前55个氨基酸）。尽管Δ1-22缺失了多个位于N端最远端的已知磷酸化位点，它仍然可以响应rKOR激活而增强多巴胺摄取，表现为在共表达rKOR和rDAT Δ1-22的EM4细胞中，U69,593仍能显著提高摄取能力。相比之下，在转染rKOR和rDAT Δ1-55的细胞中，U69,593则无法增强多巴胺摄取。鉴于Thr53位于Δ1-55与Δ1-22之间的区别区域，进一步将Thr53突变为丙氨酸（rDAT Ala53），以阻止该位点的磷酸化。在共转染rKOR和不同DAT突变体的EM4细胞中进行单点和饱和摄取分析发现，Thr53的磷酸化能力对于U69,593增强多巴胺摄取具有决定性作用。饱和分析还显示，rDAT Ala53的基础摄取能力显著降低，相比野生型rDAT，其Vmax也显著下降。

图二 KOR激活在体内增强了NAc中DAT介导的多巴胺清除作用

在转染细胞中作者已证实，rDAT Thr53的磷酸化在KOR依赖的转运体膜转运和多巴胺摄取增强过程中起关键作用。接下来，进一步探讨这些发现是否能在天然组织中得到验证。在大鼠纹状体突触体中应用U69,593后显著增加了Thr53磷酸化DAT的免疫反应信号；而使用MEK1/2抑制剂U0216（位于ERK1/2上游）可阻断这一效应。为了评估在体内激活KOR是否也能提高DAT Thr53的磷酸化水平，给雄性大鼠注射U69,593或给予溶剂对照。为了分析调控DAT膜转运的D2受体相关神经环路机制是否也适用于KOR，通过蛋白质印迹法检测了全身给予U69,593对背侧纹状体（DS）和腹侧纹状体（VS）中p-Thr53 DAT的影响。结果显示，在DS和VS中，U69,593均引起p-Thr53 DAT的时间依赖性增加，并在注射后120分钟达到峰值。发现局部注射U69,593可缩短DA清除时间，表现为清除50%（T50）和80%（T80）DA信号所需时间减少。相反，在给予KOR拮抗剂norBNI预处理后，DA清除时间显著延长，提示在该记录条件下，存在一定程度的内源性KOR激活但未达饱和。

图三 norBNI治疗可纠正DAT Val559小鼠中由性别决定的行为表型异常

与D2受体持续激活并抑制囊泡多巴胺释放的机制一致，离体研究发现，雄性DAT Val559小鼠纹状体切片中诱发的多巴胺囊泡释放显著减少。此外，在这些动物的背侧纹状体中进行的在体微透析实验显示，注射可卡因后细胞外多巴胺水平不再升高。作者提出假设：由于mKOR抑制能够降低异常升高的、易于外排的mDAT Val559在细胞膜上的基础转运水平，因此可能恢复体内囊泡多巴胺的释放。通过在体微透析实验发现，当在雄性小鼠注射可卡因前80分钟预先给予norBNI，DAT Val559小鼠在注射可卡因后出现了明显的细胞外多巴胺升高，其程度与野生型小鼠相当。接下来，想确定囊泡多巴胺释放的恢复是否可以纠正DAT Val559小鼠中出现的行为异常，无论性别如何。首先选择了Y迷宫自发交替测试，该测试用于评估工作记忆或重复刻板行为的变化。与野生型同窝小鼠相比，雄性DAT Val559小鼠在Y迷宫中的交替率显著下降，这种下降主要表现为对已访问过臂段的直接重复进入（即立刻返回同一臂）。急性注射norBNI显著改善了DAT Val559小鼠在Y迷宫中的交替率缺陷，同时也减少了直接重复进入的行为，且未影响运动行为。DAT Val559以性别依赖的方式影响多巴胺神经环路，导致雄性和雌性小鼠表现出不同的行为表型。为了进一步验证系统性给予norBNI是否也能逆转DAT Val559在雌性小鼠中特有的行为表型，作者采用了新物体识别（NOR）测试。在此测试中，雌性而非雄性DAT Val559小鼠在新物体偏好和辨别能力方面表现出明显差异，它们探索新物体的时间显著少于野生型对照组。同样，给予norBNI治疗后，雌性DAT Val559小鼠的新物体探索时间和辨别指数恢复到与雌性野生型小鼠相当的水平。重要的是，这些行为缺陷并未受到当天或次日测试中运动活性或总物体接触时间的影响，因为在这些指标上，雌性DAT Val559小鼠与对照组之间并无差异。综上所述，mKOR拮抗可以分别纠正雄性和雌性DAT Val559小鼠中特有的行为异常。

图四 norBNI治疗可使雄性DAT Val559小鼠对注射应激和给予可卡因后的异常运动反应恢复正常

NorBNI在体内具有长期作用。因此，作者在初次实验一周后，对同一批雄性实验动物重新进行了Y迷宫测试以评估norBNI的持续效果。初次测试一周后，接受溶剂处理的雄性DAT Val559小鼠仍然表现出明显的交替行为缺陷，这种缺陷并非由运动活性改变引起。相反，在接受norBNI治疗的DAT Val559小鼠中，其交替行为模式与溶剂处理的DAT Val559小鼠相比发生了显著变化。此外，norBNI治疗组的小鼠在重复进入行为方面与接受溶剂处理的野生型小鼠无统计学差异。而在Y迷宫测试中，norBNI治疗一周后，无论是药物处理还是基因型，对总移动距离均未产生明显影响。进一步在旷场测试（OFT）中评估了接受溶剂或norBNI处理的小鼠在给药一周后的行为表现。与DAT敲除小鼠不同，雄性或雌性DAT Val559小鼠在新环境中并不表现出过度活动，但雄性DAT Val559小鼠在即将被操作时显示出更强的运动反应性（急促跑动）。在旷场测试中，雄性DAT Val559小鼠的运动表现受到抑制，表现为移动距离、站立次数和刻板行为减少，而这一现象在野生型同窝小鼠中并不存在。提前七天注射norBNI可使这些指标恢复正常。作者推测，生理盐水处理的DAT Val559小鼠运动能力下降可能反映了操作后焦虑水平升高，因为DAT Val559小鼠在开放场中心区域停留的时间明显减少，而该行为指标通常对抗焦虑药物有反应。系统性给予norBNI也能够纠正这一异常。此外，DAT Val559小鼠对精神兴奋剂（如可卡因）的运动反应减弱。而在测试前一周给予norBNI预处理，恢复了雄性DAT Val559小鼠对系统性可卡因的运动反应。在norBNI治疗组中，可卡因诱导的运动增强同时伴随着在测试箱中心区域停留时间的增加，而这一现象在生理盐水处理的对照组中并未出现。

总结

总之，该研究利用一种具有结构效度的、基于遗传性DAT功能障碍的临床前模型发现抑制KOR能够纠正因多巴胺能神经传递紊乱所导致的异常生化和行为后果，进一步支持将KOR拮抗剂用于治疗与DAT依赖性张力性多巴胺升高相关疾病的潜力。此外，研究还揭示了D2受体（D2AR）与KOR信号通路之间的相互作用，它们在基础状态下共同调控DAT功能和多巴胺神经传递，并通过增强囊泡释放，提高多巴胺神经调制的“信号-噪声比”。

文章来源

https://doi.org/10.1038/s41380-025-03055-4