4类药物可以考虑用体外新方法替代或辅助动物试验

虽然过去几十年在减少、替代或优化非临床研究中动物使用方面取得了进展，但在首次人体试验之前，大多数新药的安全性评估仍然依赖于动物实验。除了监管要求外，啮齿类动物、犬、小型猪、非人灵长类动物（NHPs）与人体之间生理相似性的过往经验是继续使用动物进行安全性评估的主要理由。然而，很多临床研究中出现的不良事件，在动物研究中并未被观察到。可能源于种属间在吸收、分布、代谢和排泄（ADME）参数、遗传学、靶基因表达等方面的差异。增强非临床研究结果的可转化性已成为药物开发中重要的环节。

近年来，随着新型治疗药物的增加，安全性评估的种属选择变得更加富有挑战性。一些先进治疗药物（ATMPs），如细胞和基因疗法、基于寡核苷酸的疗法、靶向蛋白降解剂（TPDs）、抗体-药物偶联物（ADCs）以及双特异性或多特异性抗体，通常对人类靶点具有高度特异性，但在其他种属中可能没有或缺乏药理学活性，原因包括对同源靶点的亲和力差异、靶点表达的完全缺失或人类与动物之间不同的下游信号通路。所以，非临床动物研究在新形势下面临更多的挑战。

ICH S6指南明确不鼓励在非相关动物种属中进行毒性研究。当不存在相关种属时，指南建议使用转基因动物或同源蛋白（“替代分子”）。ICH S6还建议进行体外研究，以协助选择合适的动物种属，例如受体占有率、受体亲和力和/或药理学效应的表征。EMA则鼓励使用基于人类材料的体外方法。这两份指南文件与FDA关于使用新方法学（NAMs）的趋势一致，最终促成了FDA现代化法案2.0出台。该法案允许制药公司在适当的情况下使用替代方法来评估药物的安全性和有效性，而不再强制要求进行动物试验。NAMs指用于毒性测试的非动物替代方法，包括基于细胞的检测、计算机模拟、器官芯片等。2025 年4 月10 日，FDA宣布计划逐步取消单抗及其他药物的动物实验要求。使用“新方法论”（包括AI 计算模型、人类细胞系、类器官以及器官芯片系统等）替代动物实验。再次使动物实验的地位出现了一丝撼动。

不过，不同药物形式具备不同的特点，也决定了所选择的非临床评价手段不同。对于小分子化药，几乎所有分子都存在脱靶结合，临床前不太可能对所有脱靶情况带来的人体风险进行全面评估。即使动物试验也做不到，甚至动物可能会使一些出现“假阳性”的分子提前止步于非临床阶段。对于大分子生物药，通常具有很高的特异性，主要毒性与靶点相关。NAMs的特点是，目前仅能针对特定问题进行研究，在处理复杂的安全性问题时，还是需要采用整体策略，比如动物实验。所以，很明显，对于生物药物这类主要来自靶点介导毒性的分子，NAMs的适用性会更强。对于脱靶风险比较高的小分子化药，NAMs远不如动物实验可靠。

来自BI、Sanofi、灵北、罗氏、GSK、辉瑞等企业的科学家根据药物作用模式和靶点特点列出了4类药物（如下图所示），认为这类药物可以使用体外人类模型替代或辅助动物，并给出了具体案例供参考，分享如下。

第一类：动物中缺少目标靶点

这类指的是候选药物的靶点在动物中不表达或动物与人体靶点之间缺乏同源性。很明显，这种情况没有合适的动物模型可用于评估靶点相关的毒性。符合这个特点的大多是新型生物药物（NBEs）。为应对这一挑战，可以采用人类体外模型来评估药物的疗效和安全性。对于免疫调节疗法，尤其是T细胞参与的免疫疗法，这种方法尤为重要，因为这些疗法几乎完全是人类特异性的，不会与动物模型中的相应靶点发生交叉反应。看几个案例。

案例1：IMCgp100（Tebentafusp）

IMCgp100是一种融合蛋白，由可溶性、亲和力增强的T细胞受体（TCR）和抗CD3单链scFv抗体组成，旨在将表达gp100表位的癌细胞（通过HLA A*02:01）与表达CD3的T细胞结合。该药物于2022年获批用于治疗葡萄膜黑色素瘤（商品名KIMMTRAK；Immunocore）。Gp100仅在人体某些类型肿瘤细胞中高表达，动物中缺乏该靶点。

对于IMCgp100及类似设计的双特异性TCR基础分子的非临床疗效和安全性评估，Harper等人开发了一套以2D人类癌细胞系为核心的纯体外评估方案。在疗效评估方面，使用抗原特异性、与适应症相关的肿瘤细胞来测量抗原呈递对靶细胞杀伤的影响。IFNγ释放和肿瘤细胞体外杀伤的数据有助于计算最低预期生物效应水平（MABEL）。

安全性评估方面，将表达靶点的或不表达靶点的人类原代黑素细胞作为靶细胞，并使用单一供体的外周血单个核细胞（PBMCs）作为效应细胞，以研究靶向/非肿瘤活性。非靶向或非肿瘤效应通过使用人类全血进行细胞因子释放试验（CRA）和血小板激活试验来评估，以评估广泛免疫激活的风险。通过将效应T细胞与覆盖独特、最常见HLA亚型的广泛人类原代细胞和细胞系共同培养，并使用ELISpot技术定量检测IFNγ释放，评估对替代HLA亚型的识别风险。同时，还采用计算机模拟方法，通过识别人类基因组中与靶点序列高度同源的肽段，进一步评估分子的安全性和特异性。

这些数据提供了关于IMCgp100的治疗潜力、靶向与非靶向特异性以及潜在安全性方面的信息。这种方法用于确定首次人体试验的安全起始剂量，并帮助推进该疗法进入临床开发。这种完全基于体外的非临床评估方案代表了TCR基础疗法非临床评估的潜在范式转变，提供了一种更符合人类情况的动物替代方案。

案例2：MEDI-565

MEDI-565是一种新型双特异性T细胞连接器（BiTE）抗体，旨在将表达癌胚抗原（CEA）的癌细胞与表达CD3的T细胞结合。研究表明，MEDI-565可与人类和食蟹猴的CEA结合，但不与食蟹猴的CD3结合，且啮齿动物不表达CEA。MEDI-565的安全性评估方案包括用于食蟹猴的替代双特异性抗体和人类CEA转基因小鼠。然而，研究发现替代分子与MEDI-565相比具有非特异性结合介导的活性，以及不同的亲和力、体外效力、动力学和T细胞激活幅度。最终决定不进行任何体内毒理学研究，而是采用纯体外方法支持非临床评估，并确定MABEL。

使用人类PBMCs和CEA阳性人类肿瘤靶细胞的共培养，通过多个合适终点（包括细胞因子释放、肿瘤细胞溶解、T细胞激活和增殖以及受体占有率）来确定MABEL，采用最敏感终点的EC20计算。通过使用体外得出的MABEL浓度和食蟹猴PK研究数据预测的人类PK参数，确定了MEDI-565在表达CEA的癌症患者中进行I期临床研究的安全起始剂量。

随后在患有晚期或难治性胃肠道腺癌的患者中进行的I期剂量递增研究表明，腹痛和腹泻是最常报告的不良事件之一。这与CEA在肠道内衬上皮细胞的表达有关。因此，在非临床安全性评估中纳入一个复杂的人类肠道细胞模型，例如能够重现人类肠道上皮细胞三维结构和转录组的原代人类类器官模型，将有助于识别靶向毒性风险。

案例3：EpCAM和CEA靶向的T细胞连接双抗（TCBs）

在2024年的研究中，Harter等人讨论了靶向癌细胞上的上皮细胞黏附分子（EpCAM）或CEA以及T细胞上的CD3的TCBs。这些抗体被开发用于治疗实体瘤，但在I期临床试验中出现了腹泻这一副作用。这一副作用与EpCAM和CEA在健康肠道中的表达相关。对接受EpCAM靶向TCB治疗的患者进行内窥镜检查显示，上皮细胞受损，单核细胞浸润到黏膜中，同时血清中炎症细胞因子IFNγ、IL-6和IL-8水平升高。

在临床前开发过程中，虽然使用了动物模型，但未能预测EpCAM靶向或CEA靶向TCBs以及CEA靶向嵌合抗原受体（CAR）T细胞的肠道风险。这可能是由于种属间免疫学差异以及人类特异性亚型缺失或靶点在组织中的相关表达缺失。因此，研究人员调查了患者来源的肠道类器官是否可以再现由EpCAM/CEA靶向TCBs引发的临床毒性。

将补充和共包裹了PBMCs的肠道类器官模型置于水凝胶中，并用EpCAM靶向TCB进行处理，监测通过caspase-3/7诱导的免疫介导的上皮细胞溶解。该模型还评估了CEA靶向TCBs的潜在毒性，测试了高亲和力和低亲和力分子（分别称为CEAhi TCB和CEAlo TCB）。结果显示，所有靶向黏膜的分子均在类器官中引发了强烈的时间和浓度依赖性凋亡诱导，证明了该系统对靶点表达和抗体亲和力等参数的敏感性。例如，EpCAM靶向TCBs比CEA靶向分子引发了更快且更严重的类器官细胞毒性，这与EpCAM更高的可及性一致。同样，CEAhi TCBs比CEAlo TCBs更具破坏性。重要的是，这些结果与临床报告一致，即与CEA靶向双抗相比，EpCAM靶向双抗更频繁且更严重地引发肠道不良事件。

这些发现表明，人类类器官可以提供一个强大且灵敏的试验系统，用于模拟健康器官中的靶向TCB介导的毒性。证明了补充了PBMCs的健康患者来源类器官在捕捉癌症免疫治疗药物（如TCBs）的免疫相关肠道毒性方面的有效性，这比动物模型具有显著优势，因为动物模型未能预测这些肠道风险。

第二类：存在种属交叉问题的靶点

这种情况是候选药物的靶点在动物中存在，但其表达水平或药理学特性与人类不同。因此，动物模型在评估靶向毒性方面的转化价值可能受到挑战。例如，如果靶点在动物的某些器官中过表达或缺失，与人类相比，药物候选物在动物中诱导的效应可能无法预测人类中的反应。这可能导致在动物模型中出现不相关的非临床不良反应，或者更重要的是，动物模型中缺乏或低估了与人类相关的不良反应。即所谓的“假阳性”或“假阴性”。

如果第一类分子主要出现在NBEs中，第二类情况通常同时出现在NBEs和小分子化学药物（NCEs）中。尽管第一类情况中描述的一些体外解决方案也可以在此类中使用，但目前完全不使用动物的测试策略并不现实。NCEs很少是100%靶向特异性的，大多会诱导非靶向效应。数据表明，小分子药物可能会与大约6-12个非预期靶点结合。此外，动物中不同的靶点表达谱并不能排除靶向毒性的出现。因此，对于这一类别的化合物，体外测试将是对体内研究的补充，而不是完全替代，安全性评估方案主要由针对器官或组织特异性的体外测试组成，使用人类和动物的细胞模型来识别非临床种属与人类之间的差异。

案例1：BAY 2666605

作为支持抗肿瘤NCE BAY 2666605进入首次人体试验的一部分，研究者开展了大鼠和NHPs的体内毒性研究。BAY 2666605能够诱导两个靶点PDE3A和SLFN12之间形成复合物，这两个靶点在某些癌症中过表达。其中一个靶点SLFN12显示出高度的种属特异性（在NHPs中序列同源性为90%，但在大鼠中仅为53%，且大鼠中没有表达同源蛋白），而PDE3A在不同种属间的同源性水平足够高（小鼠和大鼠为84%、犬为90%、NHPs >98%）。然而，PDE3A-SLFN12复合物的形成尚未在NHPs中得到确认。在人类中，这两个靶点的相互作用在多种癌症模型中引起抗增殖和细胞毒性效应，从而有助于克服药物耐药。

在4周NHPs毒性研究中未观察到毒性效应，表明其安全性良好。然而，由于在人类中，这两个相互作用的靶点不仅在疾病组织中表达，还在主动脉组织中共表达，因此NHPs研究结果的转化性受到质疑。然而，在NHPs中即使在高暴露水平下也未观察到主动脉血管损伤。研究者决定使用体外实验，比较人类和NHPs主动脉平滑肌和内皮细胞培养中的效应。结果显示，人或NHPs主动脉平滑肌未见细胞毒性。人类主动脉内皮细胞中看到细胞毒性，但引发毒性的化合物浓度高于选定FIH起始剂量的预计最大游离药物浓度。在NHP主动脉内皮组织中，也观察到细胞毒性，出现毒性的浓度低于NHPs 4周毒性研究中达到的稳态最大游离药物浓度，但体内毒理研究未见血管损伤的证据。因此，认为观察到的体外效应不太可能直接转化为临床上相关的血管损伤风险。

由于BAY 2666605的两个靶点在啮齿动物中不表达，大鼠体内研究的价值仅限于评估NCE的潜在脱靶毒性。

案例2：SAR444559

SAR444559是一款抗CD38单克隆抗体，在食蟹猴单次和重复给药毒性研究中观察到再生性溶血性贫血。全血体外研究表明，在食蟹猴血液中，SAR444559处理后出现了浓度依赖性的红细胞凝集，但在人类血液样本中没有观察到这种现象。对食蟹猴和人类红细胞上的CD38表达水平进行评估，结果显示食蟹猴红细胞上的CD38表达水平更高，这支持了毒性研究中观察到的溶血性贫血是由于食蟹猴红细胞上靶点表达更高而导致的种属特异性靶点介导的反应。体外研究救了SAR444559一把，助力其推进到I期临床研究。

第三类：哺乳动物中不存在的靶点

这一类也称为“外来靶点”，指那些在动物或健康人类中不存在的药物靶点。例如，针对传染病的药物靶向微生物蛋白，如果这些蛋白缺乏人类同源物，则不会产生靶点相关的毒性。类似情况也出现在人类疾病进展中被修饰的靶点上，如阿尔茨海默病中，神经纤维缠结中微管相关蛋白tau的病理性过度磷酸化在健康志愿者或用于安全性评估的健康动物中并不存在。

这种情况，开展人类细胞进行体外毒性测试能提供的帮助也很有限，反而计算机模拟（in silico）方法可能有助于调查脱靶毒性。当然，对于NCEs，仍然需要在标准动物研究中评估潜在的脱靶风险。

案例1：疟疾药物M5717

疟疾由五种疟原虫引起。对于寄生虫这种外来靶点，靶向毒性的评估并不容易实现。可以考虑使用一些数据库或其它工具，研究寄生虫靶点蛋白序列与哺乳动物蛋白质组之间的潜在同源性。有助于先导化合物优化阶段选择对寄生虫靶点具有更高选择性的分子。

Merck Healthcare KGaA开发的抗疟疾药物候选物M5717是一种首创的小分子化合物，它抑制了多种疟原虫中细胞质蛋白合成的PeEF2。抑制PeEF2会影响疟原虫感染的红细胞中的蛋白质合成。 M5717在浓度至少是疟原虫EC50的1000倍时，对HepG2细胞（一种人肝癌细胞）的蛋白质合成没有抑制作用。说明该化合物选择性地作用于疟原虫的靶点，不与人类蛋白发生交叉反应。

对于外来靶点，选择毒理学种属就不能依赖药理学作用了，应基于药物候选物的ADME特性以及代谢物谱。动物只能用于研究靶点以外的脱靶毒性。在进入II期临床试验的M5717案例中，尚未观察到此类毒性。

案例2：核苷（酸）类似物

核苷（酸）类似物已被批准用于治疗由单纯疱疹病毒1型、HIV、HBV、HCV、流感病毒、呼吸道合胞病毒、埃博拉病毒和SARS-CoV-2引起的感染。这类药物通常抑制哺乳动物中不存在的病毒DNA或RNA聚合酶。不过，有几款药物出现了针对哺乳动物蛋白的非靶向效应相关的安全性问题。

比如第一个被批准用于抗病毒治疗的HIV-1逆转录酶抑制剂叠氮胸苷（AZT），与心肌病和乳酸酸中毒有关。1993年，一种用于HBV治疗的核苷类似物—菲亚拉滨的II期研究因一名患者出现突发肝衰竭、休克和乳酸酸中毒而立即终止。在这项研究的最初几周随访中，七名患者出现肝衰竭，其中五人死亡，两人需要进行肝移植。对AZT、菲亚拉滨和其他核苷类似物的详细研究表明，抑制人类线粒体DNA聚合酶γ及其导致的线粒体毒性是罪魁祸首。

抑制线粒体DNA聚合酶γ会导致链终止、复制失败或核苷（酸）的插入，从而产生功能失调的蛋白。由于插入的核苷（酸）积累，可能会导致延迟毒性，这使得在较短期的IND支持性临床前动物研究中难以检测到。因此，这一类药物的开发已演变为包括动物研究以及使用基于人类材料的支持性研究。

例如，针对HCV的NS5B聚合酶抑制剂索非布韦的临床前安全性评估包括两个种属中的临床前研究，以及在相关细胞系（如前列腺癌细胞系PC-3）中对线粒体功能的影响评估。体外线粒体功能的生化评估、重组线粒体DNA聚合酶γ和RNA聚合酶活性也被用于核苷和核苷酸类似物的安全性评估。

第四类：无法预测临床事件的药物

这类指的是不同种属中与靶点表达状态无关、导致人类特异性毒性发现的候选药物。所有在人类中出现不良反应但未在非临床动物研究中被检测或预测到的药物，都可以考虑使用人类相关体外模型进行回顾性机制毒性研究。

回顾性毒理机制研究也是新方法的一个重要应用方向。例如，对于药物诱导的肝损伤（DILI），肝脏球体是很有前景的模型，预计这种模型在微生理系统（MPS）平台中的应用将增加对人类特异性机制和动物研究转化限制的理解。将人类组织的MPS与基于生理的药代动力学（PBPK）建模或定量系统毒理学（QST）相结合，以模拟和比较化合物暴露效应以及变化的代谢物（例如胆汁酸）谱，尤其具有前景。

案例1：BAY 1128688

BAY 1128688是一种选择性抑制AKR1C3的小分子化合物，潜在治疗子宫内膜异位症。在该候选药物的非临床评估中，包括对雌性大鼠和食蟹猴进行为期4周或13周的重复给药毒性研究。雌性大鼠为70 mg/kg BAY 1128688，雌性猴为40 mg/kg BAY 1128688，持续13周，被定为NOAEL。分别相当于预期人类暴露量的约21倍（大鼠）和16倍（猴），而预期人类最大临床剂量为60 mg，每天两次。

随后，BAY 1128688在健康志愿者中进行了长达4周的多次给药研究。在单次或多次给药后，观察到血清总胆红素的剂量依赖性轻度增加，但未伴随血清转氨酶增加。在随后的IIa期试验中，涉及有症状的子宫内膜异位症的成年绝经前女性，治疗结束时（即治疗超过8周后）检测到肝毒性。在十名参与者（8.3%）中观察到ALT从正常范围上限的2倍增加到76倍。因此，试验被提前终止。

分析发现，BAY 1128688是人类肝细胞摄取和外排过程（特别是胆红素和胆汁酸运输）中常见转运蛋白的抑制剂（胆汁酸外排泵[BSEP]和多药耐药相关蛋白）。BSEP抑制是肝毒性最可能的原因，导致胆汁酸稳态改变和有毒胆汁酸在肝细胞中的积累。

这些胆汁酸稳态的改变显然未在非临床动物研究中得到充分反映，从而限制了对DILI风险的预测。人类的有毒疏水性胆汁酸比例更高，而啮齿动物的毒性较小的极性胆汁酸比例更高。

动物研究未能识别潜在人类肝脏安全性问题，突显了体外机制研究在识别人类DILI风险方面的重要性。使用QST建模工具DILIsym进行的机制研究显示，抑制胆汁酸转运蛋白可能导致胆汁酸积累和轻度肝毒性，尽管肝毒性的程度和时间进程预测得不太准确。

案例2：抗CD154单克隆抗体Hu5c8

传统测试未能预测到Hu5c8在临床试验中观察到的严重血栓。Barrile等人开发了一种名为“Vessel-Chip”的微工程模型，该模型模拟人类内皮功能，并评估Hu5c8引起的血栓形成反应。这种器官芯片（OoC）通过使用人类内皮和血液成分来密切模拟人类生理反应。利用该模型，使用疾病相关的可溶性配体sCD40L的浓度以及可能具有临床相关性的Hu5c8浓度，研究人员在体外回顾性地揭示了Hu5c8的促血栓形成效应。作为血栓形成潜力的指标，Hu5c8诱导了纤维蛋白凝块形成，这依赖于FcγRIIa受体。重要的是，这种效应未在Hu5c8-IgG2r（一种不结合FcγRIIa受体的抗体）中检测到，表明新一代抗CD40L单克隆抗体可能具有低血栓形成风险。

案例3：SPC5001的肾毒性评估

SPC5001是一款反义寡核苷酸（ASO），动物研究未能预测到SPC5001在临床试验中引起的急性肾损伤。Nieskens等人使用肾脏近曲小管芯片模型来评估SPC5001诱导的肾毒性。结果表明，SPC5001在芯片上培养的人类肾近曲小管上皮细胞中诱导了细胞毒性，并增加了肾脏损伤生物标志物的水平，尤其是在延长暴露时间后。这些发现强调了肾脏芯片技术作为药物开发中有价值的工具的潜力，用于评估肾毒性，提高对治疗性ASOs人体反应的可预测性，从而减少对动物实验的依赖。