《食品科学》：宁夏大学罗瑞明教授等：宰后成熟期间细胞凋亡酶-3抑制剂对滩羊肉保水性及嫩度的影响

保水性和嫩度是反映宰后肉品多汁性和咀嚼性的重要指标，关乎肉品的食用价值和经济效益。宰后成熟是调控肉品质的关键环节。

钙蛋白酶（Calpains）与细胞凋亡酶（Caspase）是公认的宰后成熟过程重要的蛋白水解酶。Ac-DEVD-CHO（N-acetyl-Asp-Glu-Val-Aspaldehyde）是一种基于Caspase-3底物识别基序的四肽（Asp-Glu-Val-Asp），其N端偶联乙酰基（用于增强化学稳定性），C端偶联醛基（用于不可逆地灭活Caspase-3），能够有效抑制Caspase-3活性，并介导其引起的一系列细胞凋亡。

宁夏大学食品科学与工程学院的马萌、马佳荣、罗瑞明*等选取宰后滩羊后腿肌为研究对象，通过注射Caspase-3抑制剂DEVD影响肌肉组织内细胞凋亡的进程，通过分析4 ℃条件下不同成熟时间点肌肉pH值、水分分布、微观结构、肌原纤维蛋白降解以及保水性和嫩度等相关指标变化情况，探究并阐释宰后成熟过程Caspase-3对滩羊肉保水性和嫩度的影响机制，以期进一步为滩羊肉宰后贮藏过程嫩度和保水性关键技术研究提供参考，为改善滩羊肉嫩度、减少产品汁液流失提供新思路。

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宰后成熟期间滩羊肉Caspase-3及Caspase-9活性变化

Caspase-3和Caspase-9是细胞凋亡反应中重要的两种酶，可以表征细胞凋亡的发生。由图1A可知，宰后0～96 h，对照组Caspase-3活性呈先上升后下降的趋势，且显著高于DEVD处理组（P＜0.05）。DEVD处理组Caspase-3活性呈现先下降后上升再下降的趋势，在宰后6 h显著降低了25.01%（P＜0.05），随后至96 h迅速上升了29.55%，并达到最大活性。对照组Caspase-3活性变化趋势与在牛肉及牦牛样本中的研究结果一致，且DEVD处理组同样抑制Caspase-3活性，但宰后初期趋势不同，原因可能为动物种类不同造成Caspase-3活性受抑制程度不同，滩羊受抑制程度更高。由图1B可知，对照组Caspase-9活性整体高于DEVD处理组，且在12 h达到最低活性（6.79 U），DEVD处理组Caspase-9活性在宰后0～24 h显著下降了22.39%（P＜0.05）。造成这一结果的原因是DEVD抑制了细胞质中由氧化细胞色素c产生的凋亡体。宰后12～48 h，DEVD处理组Caspase-9活性始终显著低于对照组（P＜0.05），随着贮藏时间的延长，DEVD的抑制效果降低。氧化细胞色素c含量增加，引起Caspase级联反应放大。最后，Caspase-9的活性增加。结果表明，抑制剂DEVD可能会在储存过程中延迟Caspase级联反应的过程，DEVD组的Caspase-3和Caspase-9水平达到最大值的时间晚于对照样品，成功抑制了Caspase-3和Caspase-9活性。

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宰后成熟期间滩羊肉pH值变化

如图2所示，对照组pH值在宰后0～96 h内呈现显著下降趋势（P＜0.05），并在96 h时达到最低（pH 5.52），随着成熟时间延长，pH值又有所回升，这是因为肌肉中积累的乳酸逐渐被消耗，微生物代谢产生碱性物质，蛋白质与脂肪氧化产生的醛类、酮类等造成pH值回升。DEVD处理组整体趋势和对照组相似，宰后0～6 h，DEVD处理组略高于对照组，且pH值在24～48 h显著低于对照组（P＜0.05）。DEVD处理组pH值于48 h提前达到最低（pH 5.50），随后迅速回升。滩羊肉屠宰后早期pH值迅速下降可以促进肌浆蛋白变性和活性氧（ROS）积累，进一步加剧了线粒体功能障碍和细胞色素c氧化，从而激活Caspase-3改善肌肉嫩度。本实验中，由于处理组抑制Caspase-3活性，宰后初期DEVD处理组pH值高于对照组，随后pH值迅速下降并低于对照组，但最终pH值又大幅回升并超过处理组，最终结果是嫩化过程和死后凋亡过程减慢。

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宰后成熟期间保水性指标变化

离心损失和蒸煮损失是肉品保水率的重要指标，与肉品多汁性高度相关。由图3可知，宰后对照组和DEVD处理组离心损失率和蒸煮损失率整体均呈先上升后下降的趋势（P＜0.05）。如图3A所示，DEVD处理组在宰后6～96 h离心损失迅速上升并达到最大（18.79%），显著高于对照组（P＜0.05）。如图3B所示，在宰后6～192 h，对照组和DEVD组蒸煮损失分别升高了6.13%和9.76%。此外，24～192 h对照组蒸煮损失显著低于DEVD处理组（P＜0.05）。肌肉宰后成熟过程中pH值快速下降导致蛋白质变性是肌肉水分流失水平高的主要原因。本实验中处理组pH值迅速下降造成水分的流失，结果表明宰后DEVD处理对滩羊肉保水性产生负面影响。

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宰后成熟期间滩羊肉水分分布变化

为了进一步探究宰后Caspase-3是否对滩羊肉内部水分迁移以及水分分布状态产生影响，采用无损且无创伤的低场核磁共振光谱进行检测。通过观察横向弛豫时间变化评估宰后滩羊肉不同成熟时间段系水力。滩羊宰后成熟横向弛豫时间变化如图4所示，整个成熟过程滩羊肉横向弛豫时间出现了3 个峰段特征起伏，分别为T21（0.1～10 ms）、T22（10～100 ms）和T23（100～1 000 ms）。其中T21所对应峰表征存在于滩羊肌肉组织中与分子紧密结合且不易流失的结合水；T22峰段表征在肌纤维网络结构中束缚的不易流动水；T23峰段表征困在肌纤维束间包括肌浆蛋白在内的自由水。由图4A可知，对照组不易流动水（T22）峰比例最高，且随着滩羊肉的成熟逐渐呈现缩小趋势，如图4B所示，DEVD处理组T22处峰比例变化程度明显高于对照组。结果表明，宰后DEVD处理滩羊肉系水力变差。

如图5所示，整个成熟过程T21（结合水）受影响较小，对照组和DEVD处理组无明显变化。T22处弛豫时间呈现下降趋势，且DEVD处理组在T22下降趋势较对照组明显。T23处弛豫时间呈现显著下降趋势（P＜0.05），宰后6～192 h，DEVD处理组和对照组自由水含量分别降低了35.50%和47.24%。宰后肌肉pH值的变化与持水能力密切相关，由于处理组的pH值在宰后迅速下降，导致肌原纤维蛋白和肌浆蛋白变性，减小了肌原纤维内空间，肌原纤维内水被输送到肌原纤维外，从而导致水分损失增加。宰后肌肉组织的水分逐渐迁移主要以自由水和不易流动水的形式流失，且DEVD处理滩羊肉保水性变差。综上，随着宰后滩羊肉的成熟，Caspase-3通过影响肌肉内部水分分布及迁移，进而调控滩羊肉保水性。

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宰后成熟期间滩羊肉MFI变化

宰后成熟过程，随着肌肉内环境条件的改变，在Caspase和Calpains等的共同作用下，细胞凋亡级联反应发生，肌纤维断裂发生小片化，肉的嫩度得到改善。如图6所示，宰后0～192 h，对照组和DEVD处理组MFI呈现逐渐上升趋势，且DEVD处理组的上升趋势显著低于对照组（P＜0.05），与其他研究的趋势相同，DEVD处理组显著降低了MFI。对照组在48 h时MFI达到了DEVD处理组的1.30 倍。整个成熟阶段对照组MFI显著增大了82.92，DEVD组MFI显著上升了26.27。Caspase抑制剂在宰后早期的嫩化成熟过程中起着重要作用，当Caspase被抑制时，即使其他内源酶能发挥降解作用，嫩化效果也明显下降。因此，Caspase-3和其他内源性嫩化因子之间的关系可能依赖于凋亡相关酶。表明在存在其他内源性酶的情况下，抑制Caspase-3也会导致嫩化过程和死后衰老过程减慢。

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宰后成熟期间滩羊肉剪切力的变化

剪切力对衡量肉品嫩度变化有重要意义，较低剪切力的肉品具有较好的嫩度口感。如图7所示，宰后6～192 h对照组和DEVD处理组剪切力变化趋向一致，呈现先显著上升后显著下降趋势（P＜0.05）。DEVD处理组剪切力在整个成熟阶段均显著高于对照组（P＜0.05），并于48 h时达到最大剪切力（35.29 N），为对照组的1.42 倍。宰后6～48 h，对照组剪切力显著上升了35.33%（P＜0.05），而DEVD处理组剪切力显著上升了39.3%（P＜0.05）。这些结果表明，Caspase-3抑制剂减弱了细胞凋亡过程，抑制了肌肉的软化。由此可见，宰后成熟DEVD处理不利于滩羊肉嫩化。

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宰后成熟期间滩羊肉肌纤维蛋白降解情况

肌钙蛋白-T作为蛋白质降解的标志产物，与肉品嫩度和持水性密切相关，其特征降解片段通常在30 kDa处出现，为了进一步明确宰后Caspase对滩羊肉保水性和嫩度的影响机制，对滩羊肉内部肌原纤维蛋白降解情况进行测定。由图8A可知，随着宰后成熟，蛋白条带降解产物不断增多。值得关注的是，宰后24 h对照组出现少量30 kDa片段降解产物，此时也是对照组MFI大幅上升的开始，说明肌钙蛋白-T的消失与宰后衰老中肉的嫩度密切相关。如图8C所示，DEVD处理组宰后前期降解整体少于对照组，在96 h后大量降解，随着成熟时间延长降解片段逐渐增多，且96 h灰度值明显高于对照组，说明宰后前期DEVD起作用，抑制了肌原纤维蛋白降解。宰后后期随着DEVD的作用减弱，肌原纤维蛋白降解速率加快。因此，本研究中对照组肌钙蛋白-T的显著降解表明宰后48 h后具有强持水能力。

MHC是肌肉中的主要结构和功能蛋白，负责骨骼肌的结构完整性，参与肌肉收缩和松弛。如图8B所示，对照组在宰后6 h MHC降解高于处理组（P＜0.05），这也解释了对照组的高嫩度，宰后后期对照组和处理组MHC降解程度于12～24 h先上升，48 h开始下降，表明肌肉成熟期间MHC降解逐步减少。综上，随着宰后成熟进行，Caspase通过影响肌钙蛋白-T和MHC降解调控滩羊肉保水性和嫩度的改变。

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宰后成熟期间滩羊肉微观结构变化情况

如图9所示，宰后0 h空白组肌纤维结构完整，肌纤维间排列致密。宰后6 h对照组和DEVD处理组肌纤维结构较完整、排列整齐，均呈现规则的暗带和明带。宰后24～192 h对照组肌原纤维断裂程度逐渐加剧，肌纤维之间逐渐产生较大的缝隙，且肌纤维明带出现明显的断裂，Z带结构逐渐模糊。值得注意的是，DEVD处理组在宰后24 h肌纤维断裂现象较对照组明显滞后，肌纤维结构相对比较完整，此外，肌节之间可以观察到明显的细胞液溢出现象。宰后48 h，DEVD处理组肌原纤维之间才逐渐出现小片化断裂，且随着成熟时间延长，小片化程度逐渐加剧，呈现不规则形状，肌原纤维彼此之间呈现较大的空隙，肌纤维结构变得松散。表明宰后成熟过程，Caspase干预肌原纤维蛋白降解，使得肌原纤维从肌膜脱落，随着降解程度加剧，形成多且宽的可供水分流出的滴水通道。

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Caspase-3作为重要的凋亡效应酶，它的激活是细胞凋亡发生的重要标志。本研究通过注射Caspase-3抑制剂AC-DEVD-CHO，发现宰后成熟前期（0～24 h），处理组Caspase-3活性相较于对照组显著降低，随后迅速回升，可能是由于宰后前期抑制剂起作用，抑制了酶活性，随着成熟时间延长，pH值迅速降低，抑制剂的抑制效果逐渐减弱，酶活性短暂性迅速回升。本研究发现，与对照组相比，抑制Caspase-3活性，Caspase-9活性也会随之降低，原因可能是宰后成熟过程线粒体通过直接释放凋亡诱导因子（AIF）激活下游的细胞凋亡级联反应发生，在细胞质中AIF直接引发Caspase-3激活，继而活化Caspase-9。

宰后成熟过程中肌肉内部酶活性变化与pH值变化引发的肌肉内环境酸化有关，肉的保水性也因此而改变。本研究结果显示，随着宰后成熟时间的延长，pH值迅速下降，DEVD处理组在48 h时，pH值显著低于对照组并达到极值（P＜0.05）。与此同时，DEVD处理组蒸煮损失率和离心损失率在宰后6～12 h与对照组差异不明显，随后在宰后24 h后显著高于对照组（P＜0.05），表明宰后前期（6～12 h）DEVD处理对滩羊肉保水性影响不大，而宰后后期24～192 h保水性明显变差。总地来说，DEVD处理通过使宰后前期pH值下降更快及后期pH值更低，对肌肉保水性造成不利影响。

嫩度是反映滩羊肉品质的重要指标，食品检测中常用剪切力和MFI表征嫩度。本研究结果表明，宰后剪切力呈现先上升后下降趋势，且在48 h达到最大剪切力。推测宰后肌肉在48 h时肌肉处于僵直期，随着pH值急速下降，肌肉在一系列内源酶作用下解僵，同时发生肌纤维小片化，因而MFI呈显著上升趋势（P＜0.05）。说明宰后肌原纤维不断降解，肉的嫩度得到改善。此前研究发现宰后牛肉嫩度和细胞凋亡酶之间显著相关。在本研究中，对照组和AC-DEVD-CHO组之间的剪切力在宰后立即开始产生明显的差异。ACDEVD-CHO组的剪切力显著高于对照组，而MFI低于对照组，表明其不利于肌肉嫩度。

肌纤维降解是嫩度改善和保水性变化的重要原因。本研究通过SDS-PAGE分析发现在宰后12 h对照组在30 kDa出现肌钙蛋白-T特征降解片段，随着成熟时间延长，在12～96 h对照组灰度值先增大后减小（P＜0.05），值得注意的是，DEVD处理组30 kDa处降解片段少于对照组，在48～192 h，灰度值显著上升（P＜0.05），说明宰后前期（0～24h）DEVD发挥作用，抑制肌钙蛋白-T降解，导致保水性变差，同时也不利于嫩度。

为了进一步探究宰后凋亡效应酶对肌肉微观结构的影响，本研究同时采用透射电镜进行观察。发现宰后成熟6 h，滩羊肉肌原纤维结构相对比较完整，且肌原纤维与肌原纤维之间结合紧密，Z线清晰，排列有序，结合pH值结果，认为此时肌肉逐渐进入僵直期。宰后6～48 h，DEVD处理组由于氧化应激，肌肉迅速收缩，肌细胞在外力作用下持水力不足，导致细胞间水分被挤出在胞浆而流失，因此保水性和嫩度较对照组差。综上结果，证明宰后早期肌肉成熟过程DEVD通过抑制Caspase-3活性，阻碍细胞凋亡发生，延长了细胞进入僵直期的进程，由于氧化应激等原因，肌肉收缩胞浆溢出，肉的持水性能和嫩度变差。宰后后期，DEVD作用减弱，随着Caspase-3活化，细胞骨架蛋白被降解，剪切力降低，嫩度改善，而持水性也随着肌原纤维的不断降解持续下降，保水性变差。

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结 论

本研究通过测定滩羊肉宰后成熟期Caspase活性、保水性和嫩度指标变化，发现宰后成熟期间滩羊肉MFI呈现上升趋势；pH值、Caspase-9活性呈现先下降后上升趋势；剪切力、蒸煮损失、离心损失和Caspase-3活性呈现先上升后下降趋势；肌原纤维降解产物呈现先减少后逐渐增多趋势。本研究发现，在宰后前期，DEVD通过抑制Caspase-3活性，保护肌原纤维完整性，减速细胞凋亡进程，降低肌原纤维降解程度，影响肌肉水分的分布，致使保水性和嫩度变差；宰后后期，随着pH值的回升，DEVD作用减弱，Caspase-3迅速活化，伴随肌原纤维蛋白的降解发生，肌肉嫩度得到改善，与此同时肌原纤维小片化加剧，肌肉结构崩塌，肌纤维间形成较大的缝隙，水分流失，滩羊肉保水性变差。本研究结果验证了Caspase-3对宰后滩羊肉肉品嫩度的改善和保水性提升具有重要影响，并阐明了其作用机理，可为宰后滩羊肉贮藏汁液流失控制及肉的嫩化形成方面研究提供理论依据。

本文《宰后成熟期间细胞凋亡酶-3抑制剂对滩羊肉保水性及嫩度的影响》来源于《食品科学》2025年46卷第5期96-105页，作者：马萌，马佳荣，高爽，梁燕群，罗瑞明。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240805-033。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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