人血清中破伤风抗体检测方法的建立和比较

中文摘要

目的建立3种破伤风抗体体外检测方法并比较。

方法分别构建间接法、双抗原法和毒素结合抑制试验体外测定破伤风抗体，对方法进行线性与范围、中间精密度、准确度、检测限的初步验证。

结果间接法在浓度范围0.007 8~1.000 0毫国际单位（mili-international unit，mIU）/mL之间呈现良好的线性关系（决定系数=0.998 6）；双抗原法在浓度范围0.078~10.000 mIU/mL之间呈现良好的线性关系（决定系数=0.998 7）；毒素结合抑制试验在浓度范围1.95~31.25 mIU/mL之间呈现良好的线性关系（相关系数＞0.98）。方法学验证结果表明3种方法在精密度、准确度、特异性等方面均符合分析方法验证的指导原则。比较3种方法的阳性检出率，差异无统计学意义（χ2=1.34，P=0.513）。

结论成功建立间接法、双抗原法和毒素结合抑制试验3种体外破伤风抗体检测法，为体外法替代体内毒素中和试验奠定研究基础。

正文

破伤风是由破伤风梭状芽孢杆菌引起的高致死性疾病，大多数破伤风病例与婴幼儿出生有关，多发生在接种疫苗不足的母亲及其新生儿中，在不卫生的分娩、流产以及不良的产后卫生和脐带护理中也较为高发。破伤风在低收入国家或卫生条件较差的地区仍然是棘手的公共卫生问题。破伤风的预防主要依靠接种破伤风疫苗，在人体内诱导一定浓度的破伤风抗体，以达到预防的作用。有研究证实在妊娠期接种3剂破伤风疫苗的有效性可达94%。婴儿时期完成3剂破伤风疫苗接种后，抗体水平虽然很高，但随着时间的推移会显著下降。根据多项血清学研究结果，WHO建议在完成婴幼儿时期的3剂疫苗接种后，在青少年阶段的合适时间再完成3剂加强接种，对破伤风的保护性免疫可持续20~30年。由于接种疫苗后对破伤风的免疫力主要由抗体介导，并且取决于特异性抗体中和破伤风痉挛毒素的能力，因此需要可靠的检测手段来评估接种疫苗后的人群是否具备对破伤风的免疫力。本研究拟通过建立并比较研究3种破伤风抗体的体外检测方法，为接种疫苗后的抗体评价手段提供选择依据。

1

材料与方法

1.1

检测标本采集

遵循知情同意、自愿的原则，选择兰州大学第二医院20~59岁健康人群采集血标本；血标本经2 000×g离心5 min后分离血清，56 ℃灭活30 min后于-20 ℃保存待检。

1.2

主要试剂

破伤风类毒素（tetanus toxin，TT），浓度为670絮状单位（limit of flocculation，Lf）/ml，由武汉生物制品研究所有限责任公司生产，批号202304002C；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗人IgG（H+L）抗体购自美国Jackson公司；标准抗血清为抗破伤风免疫球蛋白（人）第1代国际标准品〔批号TE-3、效价120国际单位（international unit，IU）/支〕，TT标准物质为破伤风类毒素第2代国际标准品（批号04/150、浓度690 Lf/支），均购自英国国家生物制品检定所；抗破伤风单克隆抗体5E5和1B2由武汉迈思生物科技有限公司制备，并进行HRP标记。

1.3

方法

1.3.1　间接法参照WHO的相关指导文件，采用TT作为包被抗原，加入适当倍数稀释的待测血清和标准抗血清，用过碘酸钠法标记后的山羊抗人HRP结合物检测其中的破伤风抗体含量，选择适宜包被浓度及酶标记抗体工作稀释倍数，建立间接ELISA。参照中国药典2020年版四部“分析方法验证指导原则”对方法进行验证和应用研究。

1.3.2　双抗原法参照WHO的相关指导文件，用TT作为包被抗原，加入适当倍数稀释的待测血清和标准抗血清，加入HRP标记的TT作为检测抗原，建立双抗原夹心ELISA。参照“分析方法验证指导原则”对方法进行验证和应用研究。

1.3.3　毒素结合抑制（toxin binding inhibition，ToBI）试验参照WHO的指导文件和相关文献，将稀释后的待测血清及标准抗血清与稀释至0.1 Lf/mL的TT标准品在体外孵育2 h，然后将孵育混合物转移至包被抗体5E5的酶标板中，再加入HRP标记的抗体1B2，通过体外检测未结合的TT含量来评估待测血清中抗体水平的高低。通过计算阳性对照的均值x̅及标准差s，得出x̅-2s所对应的吸光度值，根据标准曲线求出对应的浓度值，即为该方法的检测限。

1.4

新建方法的验证与应用

1.4.1　线性与范围将标准品稀释至已确定的线性范围内的各浓度，每个浓度水平重复测定6次。接受标准：每个浓度水平的检测差异变异系数（coefficient of variation，CV）≤20%，拟合直线的相关系数（r）≥0.98，决定系数（R2）≥0.99。

1.4.2　精密度按照各种方法的线性范围，将标准品分别稀释至高（0.80 mIU/mL）、中（0.50 mIU/mL）、低（0.05 mIU/mL）3种浓度水平；每种浓度水平重复测定6次进行重复性验证；由1位操作员在不同时间测定上述3种浓度水平，进行中间精密度验证。接受标准：每种浓度水平重复测定的检测CV≤15%，不同时间检测每种浓度水平之间的CV≤15%。

1.4.3　准确度按照各种方法的线性范围，将标准品分别稀释至高、中、低3种浓度水平，每种浓度的样品平行稀释6份，检测其抗原含量。计算同一浓度样品测定结果的CV，并将实测值与理论值比较，计算回收率。接受标准：同一浓度检测结果CV≤15%，各浓度水平的检测回收率在80%~120%。

1.5

统计学方法

使用Minitab17、GraphPad Prism 8.0.2及Excel 2010软件进行数据统计和处理，描述性分析3种体外检测破伤风抗体方法的相关性，并采用卡方检验评价检测率的一致性。

2

结果

2.1

间接法

2.1.1　方法建立及验证采用棋盘滴定法，选择倒S曲线平台期的最低浓度2.5 Lf/mL作为最适包被浓度，选择阳性/阴性比（P/N）值最大的酶标记抗体稀释倍数20 000倍作为工作稀释倍数，该方法在0.007 8~1.000 0 mIU/mL范围内呈现良好的线性（表1），专属性良好。线性与范围、精密度、准确度的验证结果（表1—3）表明，在检测高浓度（0.80 mIU/mL）、中浓度（0.50 mIU/mL）、低浓度（0.05 mIU/mL）标准品时，平均批间CV分别为11.03%、8.93%、13.28%，平均检测回收率分别为87.36%、90.86%、89.84%。

2.1.2　方法的应用研究应用建立的间接法对61份血样品中破伤风抗体滴度进行了检测分析，结果显示，健康人群中有一定比例的人群破伤风抗体达到保护浓度（≥0.1 IU/mL），该比例为40.98%。

2.2

双抗原法

2.2.1　方法建立及验证用过碘酸钠法将TT进行HRP标记，以TT原液作为包被抗原，采用棋盘滴定法，确定包被抗原浓度为0.04 Lf/mL，HRP标记的TT工作稀释倍数为3 000，该方法在0.078~10.000 mIU/mL范围内呈现良好的线性（表4）。验证结果（表4—6）表明：在检测高浓度（8.00 mIU/mL）、中浓度（5.00 mIU/mL）、低浓度（1.00 mIU/mL）标准品时，平均批间CV分别为12.82%、10.04%、10.50%，平均检测回收率分别为88.26%、90.13%、90.17%。

2.2.2　方法的应用研究应用建立的双抗原法对61份血样品中破伤风抗体滴度进行了检测分析，结果与间接法测定结果一致：在健康人群中有一定比例的人破伤风抗体达到保护浓度（≥0.1 IU/mL），该比例为31.15%。

2.3

ToBI试验

2.3.1　方法建立及验证将待测血样本稀释至合适浓度，加入一定浓度的TT标准物质，同时设定空白对照孔和阳性对照孔，确定最大P/N条件下的酶标记抗体1B2稀释倍数4 000倍作为最适稀释倍数，在1.95~31.25 mIU/mL的效价范围内，吸光度值与效价呈现良好的梯度关系（表7），四参数拟合的r大于0.98；通过计算，得出该方法的最低检测效价为1.70 mIU/mL。

2.3.2　方法的应用研究应用建立的ToBI，对61份血样品中破伤风抗体滴度进行了检测分析，结果与间接法、双抗原法测定结果一致：在健康人群中有一定比例的人破伤风抗体达到保护浓度（≥0.1 IU/mL），该比例为35.00%。

2.4

3种破伤风抗体体外检测法阳性检出率的比较

间接法、双抗原法、ToBI均检测出一定比例的破伤风抗体阳性血清（表8），其中间接法阳性检出率最高，而双抗原法和ToBI的阳性检出率比较接近。对3种体外法的检测结果进行卡方检验：χ2=1.34，P=0.513，表明3种方法的检出率差异无统计学意义。

3

本研究建立了3种破伤风抗体体外检测法，经初步验证，均具有良好的特异性、重复性和准确性。3种检测方法应用于血样品中破伤风抗体滴度检测，对阳性样本的检出率差异无统计学意义，为破伤风疫苗效价检测新方法的建立奠定了基础。

与中国药典2020年版三部中的“小鼠试验法”相比，建立的3种破伤风抗体体外法均具有操作简便、方便快捷、重复性高的优点。一方面降低了动物痛苦和实验人员接触毒素的生物安全风险，另一方面还减少了动物的大量使用及检定人员的工作量，符合实验动物的3R原则。

间接法采用间接ELISA测定血清中破伤风抗体的水平。有文献曾报道破伤风抗体水平在0.16~0.20 IU/ml之间时，间接法与小鼠或豚鼠体内攻毒法的测定结果具有较高的相关性。双抗原法能够检测出同时与固相抗原和酶标记抗原结合的抗体，检测原理与体内中和试验中破伤风抗体必须同时与2个抗原分子结合的模式相类似，与体内中和试验具有更好的相关性。ToBI试验是模拟体内中和试验设计的体外血清检测方法，与体内中和试验具有较高的相关性；且该方法具有较高灵敏度，当抗体水平低于0.01 IU/mL时优于体内中和试验。本研究为破伤风疫苗效价检测新方法建立的关键，今后将开展以此为基础的效价检测新方法及与小鼠攻毒法一致性等方面的研究，从而进一步应用于接种破伤风疫苗后抗体水平的评估。

作者

高慧君1 张雅婷2 季雅琦3

1兰州大学第二医院临床输血科，兰州 730030；2湖北省疾病预防控制中心卫生检验所细菌检测部，武汉 430079；3武汉生物制品研究所有限责任公司科研开发部，武汉 430207

高慧君和张雅婷对本文有同等贡献

通信作者：季雅琦

Email：jyq0718@163.com

引用本文：高慧君, 张雅婷, 季雅琦.人血清中破伤风抗体检测方法的建立和比较[J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(2): 114-119.

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20240517-00029

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