BME丨杜亚楠课题组构建具有肝小叶结构的肝纤维化体外模型并探究张力介导的细胞定向迁移促进肝纤维化机制

肝纤维化是世界性的健康挑战。肝纤维化导致细胞外基质的过度沉积，形成纤维状的疤痕组织，从而扰乱肝脏的正常生理结构。在长期的慢性损伤过程中，肝纤维化会逐渐进展为肝硬化，进一步发展至肝脏功能衰竭 或诱发肝细胞癌。肝纤维化的大多数致死发生于晚期。 因此阐明早期肝纤维化如何进展为肝硬化的机理可启发新型治疗思路和手段，具有重要临床 意义。

临床上对肝纤维化的各类分期标准均与胶原蛋白在肝小叶的沉积模式相关。其中， Metavir 和另外 3 种肝纤维化分期评分体系(图1)均表明，早期胶原沉积主要呈点状在汇管区 (portal tracts) 附近分布，在 晚期会 出现 “ 汇管区到汇管区 ” (portal to portal) 的方向性分布，产生 “ 纤维间隔 ” (Septa) ， 然而如何产生这种方向性胶原蛋白分布的机制尚不明确。

图1临床常用肝纤维化分期体系中早期和晚期胶原蛋白的空间分布具有方向性

2025 年 5 月 23 日 ，清华大学生物医学工程学院教授、清华 - 北大生命联合中心研究员杜亚楠团队 在 Nature Biomedical Engineering 期刊发表题为

Tension

- induced

Directional

Migration

of

Hepatic

Stellate

Cells

Potentially

Coordinate

Liver

Fibrosis

Progression

目前大部分肝纤维化体外模型缺乏肝小叶结构。尚 不能重现肝纤维化进程中胶原蛋白的方向性分布和 “ 纤维间隔 ” 。研究团队制备了具有肝小叶结构的体外模型， 探究生物力学对肝纤维化进程中方向性胶原沉积的调控作用。

跨尺度的系统研究 ( 图 2) 。

• 器官尺度上：在小鼠肝纤维化模型中，解析表征了 “ 汇管区到汇管区 ” 具有方向性的胶原沉积和肝星形细胞分布

• 组织尺度上：首次构建具有肝小叶结构的肝纤维化体外模型，可重现体内肝纤维化进程中肝星形细胞和胶原方向性分布和纤维间隔的形成

• 细胞尺度上：使用体外胶原拉伸系统，模拟肝纤维化模型中重塑胶 原产生 的应变，发现肝星形细胞在 “ 重塑胶原 ” 上呈现方向性迁移，其迁移速度和细胞激活状态与应变大小均相关

• 分子尺度上： 证明力响应蛋白 LIMD1 的液 - 液相分离参与了对细胞方向性迁移的调控

本研究使用四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化体内模型，表征早期和晚期的病理特征。肝星形细胞是肝纤维化进程中的主要效应细胞，可大量分泌胶原导致其沉积。研究发现，在肝纤维化早期， 静息态肝星形细胞 在肝小叶中呈现弥散性分布， 激活态肝星形细胞 在汇管区附近聚集；在肝纤维化晚期， 静息态肝星形细胞 部分在汇管区附近聚集，而 激活态肝星形细胞 与重塑胶原同时形成了“汇管区到汇管区”的方向性分布（形成纤维间隔）。本研究构建了一种基于 微组织 加工技术的体外仿生“肝小叶”模型，能够重现这种胶原和肝星形细胞的分布趋势和动态变化。

为了模拟肝小叶的六边形结构，研究设计和制作了一种微型 PDMS ( 聚二甲基硅氧烷 ) 印章。这种制备方法结合了加工深度高但分辨率低的激光雕刻技术，以及加工深度低但分辨率高的光刻蚀技。这种 PDMS 印章使用时的方法类似在纸上盖章。在细胞沉降到印章内的孔状结构后，可以转印到胶原蛋白上，以形成模拟肝纤维化早期细胞分布的体外模型，即 激活态肝星形细胞 在汇管区域聚集， 静息态肝星形细胞 弥散分布于肝小叶中 。

由于巨噬细胞在肝脏纤维化进程中具有重要调控作用，本研究也尝试将具有 M1 极化表型的巨噬细胞加入到该 微组织 模型中进行共培养，并观察到其对肝纤维化进展可产生一定的抑制作用。

接下来探究了在肝纤维化体外模型中，调控细胞分布是否有生物力学因素的参与。利用激光微切割技术，发现平行于“汇管区到汇管区”方向切割时，胶原蛋白不会张开；但如果是垂直方向的切割，则会有明显张开。提示在“汇管区到汇管区”方向上存在张力，并且先于细胞形成“汇管区到汇管区”的条带状定向分布。

在激光切割后培养过程中发现，不切割和平行于“汇管区到汇管区”方向切割后，“汇管区到汇管区”的细胞条索状分布仍可出现。但如果是垂直方向的切割，细胞分布则会出现“汇管区到切口边缘”的现象，和有限元分析中的张力分布模拟结果相符 。该结果进一步提示，张力是肝纤维化体外模型中激活态星形细胞产生“汇管区到汇管区”方向性分布的主要原因。

接下来，为了精确探究张力、胶原蛋白和细胞之间的相互作用，设计了一种能适配共聚焦成像的拉伸装置，系统探究了胶原蛋白在受到仿生应变后的应力增强 (stiffening) 和定向排列 (alignment) 等特征变化 。

在将这种拉伸装置微型化后，可与活细胞工作站适配，系统表征了肝星形细胞在拉伸后“重塑胶原”上的迁移特性。 静息态肝星形细胞 随着应变增加，迁移速度先上升后下降，而 激活态肝星形细胞 的迁移速度不受应变的调控。同时静息态和激活态细胞，在拉伸强度增加后，迁移方向都会向拉伸方向偏移 。潜在解释了张力分布调控的胶原重塑以及静息态 / 激活态肝星形细胞 的动态分布特征。

最后探究了细胞在胶原蛋白上定向迁移中可能参与的分子机制。方向性的物理信号通过与胶原蛋白结合的整合素 (integrin) 传递到细胞膜内，激活了与整合素结合的力响应蛋白 LIMD1 的液 - 液相分离 (liquid-liquid phase separation) ，使其产生局部聚集，募集了更多的黏着斑组件和肌动蛋白相结合，促进了细胞在张力方向上的定向迁移。该机制进一步得到基于免疫荧光染色、荧光猝灭后恢复实验和敲除实验结果的验证。

综上，本研究通过制备具有肝小叶结构的肝纤维化体外模型，提出并验证了可解释肝纤维化早期和晚期中细胞和胶原方向性分布的潜在机制：即分布在汇管区的激活态肝星形细胞通过产生张力，导致胶原蛋白发生应力增强和定向排列。其中应力增强效应使弥散在肝小叶中的 静息态肝星形细胞 更倾向于迁移并驻留在汇管区附近，从而在晚期出现部分聚集。而定向排列效应使 激活态肝星形细胞 沿张力方向迁移，从而出现“汇管区到汇管区”的方向性分布，形成“纤维间隔”(图3)。本研究对揭示肝纤维化进展机制和开发潜在的新型干预疗法具有重要价值。

图 3 肝纤维化进展中细胞产生的张力如何调控胶原重塑和细胞分布的总结性机制

清华大学生物医学工程学院教授、清华 - 北大生命联合中心研究员杜亚楠为该文章的通讯作者，清华大学 生命科学学院博士周律为第一作者，医学院博士生石子 敖 、航空航天学院本科生杨学思、生物医学工程学院博士生曾佳楠、尤志峰、医学院博士生张钰莹、多伦多大学朱芷玥、医学院博士生刘志强、医学院博士生牛宇迪、医学院硕士生于鸿升、生命学院博士生何金亮对本研究有重要贡献。北京大学基础医学院系统生物医学研究所吴聪颖教授对本研究有重要指导。

论文链接：https://www.nature.com/articles/s41551-025-01381-0

制版人： 十一

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