南开大学等代谢工程改造假单胞菌，以木质素为碳源合成PHA

随着塑料污染问题日益严峻，寻找环保且性能优异的替代材料成为当务之急。作为一种由微生物天然合成的可降解材料，PHA 正逐渐成为塑料替代品中的“新星”。特别是中链长度的 PHA（mcl-PHA），因其独特的柔韧性和低熔点，不仅性能优异，还能广泛应用于可穿戴设备、生物医用材料和 3D 打印等多个领域，为绿色环保和高性能材料的结合提供了新的可能。

然而，PHA 的高生产成本一直是制约其推广的主要障碍，尤其是碳源成本，占发酵成本的一半以上，成为其大规模生产的关键瓶颈。为了降低成本，研究人员将目光转向了自然界中最丰富且价格低廉的可再生碳源之一——木质素。木质素不仅广泛存在于农业工业过程中的废弃副产物，其降解产物更是富含结构稳定、碳含量高的芳香族化合物，如对香豆酸（p-coumaric acid，简称 p-CA），是 PHA 的理想前体物质。

近日，来自南开大学、山东大学的研究人员合作在 Journal of Agricultural and Food Chemistry 上一篇题为“Systems Metabolic Engineering of Genome-Reduced Pseudomonas putida for Efficient Production of Polyhydroxyalkanoate from p-Coumaric Acid”的研究中，研究人员通过“系统代谢工程+基因组精简”的策略，成功构建了高性能的细胞工厂，实现了以木质素衍生物对香豆酸 p-CA 为唯一碳源的高效 PHA 合成，为我们提供了从农业废弃物到生产天然可降解材料的新思路。

研究团队以假单胞菌 KT2440 为起点，首先通过系统性基因删减，剔除了 25 个非必需区域，总删减量达 8.35%，构建出精简型菌株 KTU-U27。该菌株在细胞生长速度、基因表达稳定性、能量代谢等多方面表现出显著提升，尤其在以芳香族为碳源的条件下，展现出优异的代谢能力，为后续 PHA 合成路径的工程化提供了理想基础。

图 | KTU-U27 菌株在以对香豆酸为唯一碳源的条件下表现出更快的底物利用速率与更高的 PHA 产量

为了进一步提升 PHA 产量，研究人员还围绕合成路径中的三个关键节点进行了代谢工程改造。首先，研究人员通过删除 PHA 水解酶编码基因 phaZ，避免细胞内合成的 PHA 被降解；其次，敲除脂肪酸 β-氧化路径中的关键酶 fadBA1 与 fadBA2，以防止中间代谢物流向竞争性代谢通路；最后，在 PHA 聚合酶 phaC1 与辅酶 A 合成酶 alkK 基因前分别引入强启动子 P46，显著提升目标酶表达量，从而加强聚合反应的代谢通量。

图 | 针对 mcl-PHA 的合成路径的关节节点进行代谢工程改造

经上述工程改造后，研究人员构建出了新型工程菌 KTU-U27ΔZ2BA-P46C1K，其 PHA 产量较原始菌株提高超过 70%，发酵液中细胞干重提升至 680 mg/L，表现出明显的合成优势。

在合成能力提升的同时，团队还解决了另一个关键问题——对底物 p-CA 毒性的耐受性。实验发现，当底物 p-CA 浓度升高至 8 g/L 时，多数菌株生长受阻，PHA 产量急剧下降。为此，研究人员进一步在工程菌株 KTU-U27ΔZ2BA-P46C1K 基础上引入了跨膜转运系统 ttg2ABCDE 和外膜稳定蛋白 vacJ，并同样采用强启动子 P46 进行表达增强。

图 | 通过增强 ttg2ABCDE 与 vacJ 的表达，提高了菌株对 p-CA 的耐受性

这一改造使得菌株对高浓度 p-CA 表现出更强的耐受性和更快的底物利用速率，细胞生长曲线明显改善，发酵周期缩短，同时 PHA 积累效率显著提升。最终,构建出的 KTU-U27ΔZ2BA-P46C1K-P46TJ 成为目前已知以 p-CA 为唯一碳源生产 PHA 效率最高的工程菌之一。

而该菌株在工业化条件下测试的表现同样令人惊喜，研究人员开展了了高密度补料发酵实验，在控制碳氮比为 8:4 的条件下，该工程菌株发酵初期密度迅速提升至 2050 mg/L，PHA 含量高达 82.19 wt%，PHA 总产量达 1685 mg/L，创下了以 p-CA 为唯一碳源合成 mcl-PHA 的最高纪录。相比此前国际最先进的工程菌株 AG2162 在同类条件下产量（953 mg/L），该成果实现了近 77% 的提升。

总之，这项研究建立了一条清晰高效的从木质素衍生物到 PHA 的生物合成路径，也验证了“基因组精简+系统代谢工程策略”在构建工业底盘菌方面的可行性，即通过理性删减非必要基因，以及精准调控合成路径的关键酶表达，能够更好的达到目标产物产量和稳定性的双重提升。更重要的是，这项技术以农业和工业废弃物为原料，有望更好实现废弃物的高值化利用。

参考文献：

1.https://doi.org/10.1021/acs.jafc.5c02123

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