Nature丨基于R2逆转录转座子的新型基因编辑系统“STITCHR”

撰文丨易

真核生物基因组处于动态变化之中，转座子的活动是塑造基因组结构的重要驱动力之一。其中，非长末端重复逆转录转座子（non-LTR retrotransposons）通过 “ 复制-粘贴 ” 机制在基因组中移动，并可分为随机整合型和位点特异性整合型。位点特异性逆转录转座子（如R2家族）通常靶向高度重复的序列或多拷贝基因（如核糖体DNA，rDNA），并在进化过程中垂直传递数亿年，表明其具有保守的靶向机制。这些转座子依赖逆转录酶（RT）、DNA切割酶（RLE）和核酸结合活性完成转座过程。R2家族的转座机制已被部分解析，包括锌指（ZF）结构域介导的靶DNA结合、RLE结构域的DNA切割，以及RT结构域催化的靶向逆转录（TPRT）。然而，天然R2转座子仅能靶向特定基因组位点（如28S rDNA），限制了其在基因组编辑中的应用。

近年来，CRISPR-Cas系统的发展使基因组编辑技术取得突破，但仍面临依赖DNA双链断裂（DSB）、同源重组（HDR）效率低、难以在非分裂细胞中应用等问题。因此，研究者开始探索转座子系统的工程化改造，以开发新型基因插入工具。此前的研究已证明，R2转座子可在哺乳动物细胞中实现外源基因的靶向插入，但其天然靶向性限制了应用范围。若能重编程R2转座子的靶向性，使其可被引导至任意基因组位点，将极大拓展其在基因治疗和大片段DNA插入中的应用潜力。

近 日 ，哈佛医学院的Omar O. Abudayyeh和Jonathan S. Gootenberg教授在Nature期刊上发表题为Reprogramming site-specific retrotransposon activity to new DNA sites的研究论文，开发了名为STITCHR的新型基因编辑系统，通过工程化改造R2逆转录转座子并与CRISPR-Cas9切口酶融合，实现了在基因组任意位点的高效、精准的无痕插入，为分裂和非分裂细胞的基因治疗提供了新型工具。

作者 通过大规模生物信息学分析，对4464种动物基因组中的位点特异性nLTR逆转录转座子进行了全面鉴定和分类 ， 利用隐马尔可夫模型（HMM）分析这些转座子的保守结构域特征，特别是逆转录酶（RT）和限制性内切酶样（RLE）结构域，以预测其潜在的靶向位点偏好性。 研究 发现不同R2家族成员表现出显著的靶向偏好性差异，这一发现为理解转座子的进化提供了新的视角。体外实验证实，来自斑胸草雀的R2 Tg 转座子可通过改造其RNA模板的同源臂实现重定向，在非天然靶点如AAVS1和NOLC1位点完成插入，虽然初始效率仅为0.1%左右，但这一现象首次证明了转座子靶向性的可编程性。

其次，作者创新性地将 Sp Cas9 H840A 切口酶与R2Tg蛋白融合 ， 通过将R2 Tg 与CRISPR-Cas9切口酶融合，增强了其在新基因组位点的插入效率。经过对R2直系同源物的进一步筛选， 作者 选择具有天然重编程特性且在天然28S位点插入极少的R2 Tocc 直系同源物，构建了 Sp Cas9H840A-R2 Tocc 系统，命名为 “ 通过靶向CRISPR引导逆转录元件的位点特异性靶向引发插入系统 ” （STITCHR）。深入机制研究发现，STITCHR的编辑效率严格依赖于RT和RLE结构域的完整功能，且这两个结构域表现出反式互补的特性。在编辑精度方面，通过优化RNA载体结构（特别是截短5' UTR的设计），实现了精准的无疤痕编辑，成功在NOLC1位点插入了多种治疗相关基因，包括BTK和CEP290等大片段基因（最大达12.7 kb）。 这些结果表明 开发的STITCHR系统 具有 卓越的编辑性能。

特别值得注意的是，STITCHR系统表现出独特的非分裂细胞编辑能力。与传统的HDR依赖型编辑方法不同，STITCHR在细胞周期抑制剂处理的细胞中仍保持稳定的编辑活性，这一特性使其在终末分化细胞等非分裂细胞类型的基因治疗中具有独特优势。安全性评估显示，STITCHR系统具有极低的脱靶率，编辑事件主要集中于目标位点，且插入拷贝数稳定，未观察到串联重复插入现象。此外，研究还证实STITCHR支持多重编辑，可同时靶向AAVS1和NOLC1等多个基因组位点，为复杂基因组改造提供了新的技术路径。这些发现不仅深化了对逆转录转座子生物学的理解，更为开发新一代基因组编辑工具奠定了坚实基础，在基因治疗等 多 领域展现出广阔的应用前景。

https://doi.org/10.1038/s41586-025-08877-4

制版人： 十一

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