《食品科学》：国家林业和草原局贺亮研究员等：毛竹笋篼夏佛塔苷对胰脂肪酶的抑制作用及机理

肥胖越来越成为困扰人类的难题，过度肥胖可导致心脑血管疾病、高血压病、糖尿病等疾病，而胰腺分泌的胰脂肪酶可使摄取的油脂水解成甘油及游离脂肪酸、甘油单酯或二酯类，在小肠中被吸收后重组形成脂肪。但胰脂酶抑制剂通过抑制胰脂肪酶的活性，减少油脂的水解，从而降低脂质吸收，有效降低脂肪在人体内的积累。

毛竹笋是毛竹（

Phyllostachys edulis

）莎草目禾本科植物的新生芽，主产中国、日本、朝鲜等东南亚国家。毛竹笋作为一种纯天然、无公害的绿色食物，富含氨基酸、蛋白质、黄酮、碳水化合物及多种维生素。然而每年在加工过程中，大部分毛竹笋没有被充分利用，其笋篼部分因难以食用被直接丢弃，造成资源大量浪费和环境污染。前期研究发现，毛竹笋篼中的黄酮类化合物具有抗氧化、抗菌和降糖等作用。废弃笋篼不仅可以用于活性成分的提取加工，还可应用于食品配料的开发。

国家林业和草原局竹笋工程技术研究中心的夏张晨、孟晓慧、贺亮*等拟在前期通过大孔吸附树脂富集高浓度黄酮类物质（37.34%）的基础上，进一步借助葡聚糖凝胶纯化毛竹笋笋篼中的夏佛塔苷，再利用体外胰脂肪酶抑制动力学、内源荧光光谱、紫外吸收光谱、同步荧光光谱、三维荧光光谱及分子对接技术，从多光谱学及分子水平上解释它与胰酯肪酶的相互作用机制，以期为充分利用毛竹笋篼资源、开发降血脂类功能食品和天然抑制剂提供理论基础。

1 夏佛塔苷的分离纯化和鉴定

黄酮类物质在植物中普遍存在，但提取物中纯度一般不高，严重限制了其应用。已有许多学者利用各种手段提高其纯度。如王玥等借助锌离子络合法实现荞麦黄酮的快速分离纯化，其总黄酮含量可达57.08 g/100 g；苏娇娇等采用HPD-826大孔树脂纯化杜仲叶黄酮，纯度可达65.19%；李治等用HPD-722联合Sephadex LH-20葡聚糖凝胶纯化蜂胶总黄酮，纯度可达68.48%。本实验利用大孔树脂HPD-500分离毛竹笋篼粗提物，纯度为37.34%，再使用葡聚糖凝胶色谱从中纯化出3 个主要组分。由图1A可知，组分1（第3～37管）和组分2（第38～76管）有杂峰，峰小且多，说明组分复杂；而组分3（第76～115 管）峰形单一，无杂峰，说明是单一物质，并且组分3占所有组分峰面积约1/3，并且是黄酮类化合物。将组分3的高效液相色谱结果（图1B2）与夏佛塔苷标准品（图1B1）对比发现，二者相对保留时间一致，则可初步判断组分3是夏佛塔苷。进一步一级质谱分析该组分（6.94 min，图1C1），其准分子离子峰[MH]-为563.139 7，推算分子式为C26H28O14；在二级质谱中出现m/z 503.118 4、473.103 4、383.0 774、353.0 664等碎片离子（图1C2），可推断该分子裂解依次失去60、90、120 Da等黄酮糖苷类特征片段，最终确定组分3为夏佛塔苷类黄酮化合物，得率为5.23%（基于原料）。

2 夏佛塔苷对胰脂肪酶的抑制作用

如图2所示，在一定质量浓度范围内，两者均对胰脂肪酶具有明显的抑制作用，随夏佛塔苷质量浓度增加，其对胰脂肪酶的抑制作用先增加较快后逐渐减缓。通过多元线性回归拟合得到夏佛塔苷半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）为（76.3±0.12）μg/mL，奥利司他的IC50为（2.15±0.08）μg/mL。表明夏佛塔苷虽弱于化学合成药物奥利司他的抑制效果，但明显强于许多其他天然植物黄酮类、多酚、有机酸等物质，例如枸杞叶黄酮的IC50为0.91 mg/mL，市售茶多酚IC50为2.84 mg/mL，咖啡酸IC50为0.88 mg/mL。夏佛塔苷作为一种具有天然活性的化合物，其IC50值远低于相关文献报道的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和白杨素等对胰脂肪酶的IC50值，可能是其A环上糖苷元、B环C3和C4位上羟基取代的区别导致，且它的副作用及对人体的不良反应较小，具有很大的潜力应用于天然降脂抑制剂开发。

3 夏佛塔苷对胰脂肪酶的抑制作用类型和动力学特征

抑制剂对胰脂肪酶的抑制作用可分为可逆性抑制、不可逆性抑制和混合抑制。由图3A可知，夏佛塔苷在所有实验质量浓度条件下，酶促反应初速度随胰脂肪酶质量浓度变化的拟合直线均通过原点且斜率为正，直线斜率随抑制剂质量浓度增大而减小，由此可确定夏佛塔苷对胰脂肪酶的抑制作用类型为可逆性抑制。研究发现其他天然黄酮类物质如琯溪蜜柚柚皮苷、枸杞叶黄酮、白杨素、黑果枸杞花色苷等也均为可逆性抑制，它们可通过非共价键与蛋白酶结合从而抑制其活性。

根据酶抑制动力学特征又将可逆抑制类型分为3 种：竞争性、非竞争性和混合性抑制。绘制的Lineweaver-Burk曲线见图3，结果显示抑制剂和无抑制剂曲线接近交于纵轴，随着夏佛塔苷作用质量浓度升高，米氏常数

K

m 增大，

V

max 几乎没有变化，说明它是竞争性抑制，可与胰脂肪酶活性中心结合发挥抑制作用。其他天然黄酮类物质也有类似的现象，例如白杨素、琯溪蜜柚柚皮苷以及黑果枸杞花色苷提取物等，说明大多数含有C6-C3-C6结构的黄酮类物质易通过范德华力、氢键、疏水力等非共价键与蛋白酶的氨基酸催化位点结合，发挥抑制作用。

4 夏佛塔苷与胰脂肪酶相互作用的荧光猝灭分析

胰脂肪酶由于含有会产生强烈内源性荧光的色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr），分别在313 nm和350 nm的波长附近出现荧光峰。如图4所示，一定质量浓度的夏佛塔苷溶液加入胰脂肪酶溶液体系后，在293 K和310 K条件下均产生荧光猝灭现象。随着夏佛塔苷质量浓度的不断增加，荧光发射峰的峰形虽没有明显改变，但强度呈规律性逐渐降低，且发生轻微蓝移（蓝移约1.8 nm），说明夏佛塔苷与胰脂肪酶中的Trp、Tyr残基结合，影响它们微环境的改变，从而猝灭该蛋白的内源荧光。

荧光猝灭类型一般分为静态猝灭、动态猝灭以及混合猝灭3 种，其中前两种的Stern-Volmer曲线均为线性，而后者的猝灭曲线会有拐点。图5A和表2揭示了两种温度下，一定质量浓度范围的夏佛塔苷对胰脂肪酶荧光猝灭呈现线性Stern-Volmer曲线，

K

sv值分别为1.669×104 L/mol（293 K）和1.515 8×104 L/mol（303 K）；

K

q分别为1.669×1012 L/（mol·s）（293 K）和1.516×1012 L/（mol·s）（303 K）。其中

K

sv随着温度的上升而下降，

K

q值远远大于最大荧光猝灭常数（2.0×1010 L/（mol·s）），以上可推断夏佛塔苷分子可与胰脂肪酶结合形成复合物，其荧光猝灭类型符合静态猝灭方式。

夏佛塔苷与胰脂肪酶的结合常数

K

a 和结合位点数

n

，可通过lg（（

F

0-

F

F

）与lg [

Q

]的关系（图5B）的线性方程截距和斜率得出。由表2可知，两种温度下的结合位点

n

均为1左右，说明夏佛塔苷与胰脂肪酶存在一个结合位点。它们的结合常数

K

a分别为1.13×104 L/mol（293 K）和2.30×104 L/mol（303 K），104 数量级说明夏佛塔苷分子极易与胰脂肪酶以1∶1相互作用形成配位复合物，从而降低酶活性。该结合常数大小与白杨素、山柰酚、枸杞叶黄酮的抑制效果相接近，进一步揭示作为结构相似的黄酮类化合物，夏佛塔苷具有降脂潜力。另外，

K

a随温度的升高而升高，可能是在相互作用过程中产生了其他作用力共同维持该复合物的稳定。

热力学参数Δ

G

、Δ

S

、Δ

H

可帮助判断夏佛塔苷分子对胰脂肪酶作用力的类型。在Δ

G

＜0的条件下，当Δ

S

＞0、Δ

H

＞0为疏水作用力；Δ

S

＜0、Δ

H

＜0为氢键和范德华力；Δ

S

＞0、Δ

H

＜0为静电作用力。表2显示两种温度下夏佛塔苷分子与蛋白酶相互作用的热力学参数均为负数，说明维持夏佛塔苷与胰脂肪酶复合物稳定的主要作用力是氢键和范德华力，且该反应是自发放热过程。类似现象在其他黄酮类化合物中也有报道，例如张国文等研究表明白杨素与胰脂肪酶的反应是放热反应，疏水力和氢键是其反应的主要驱动力；张静等发现黑果枸杞的花色苷与胰脂肪酶的相互作用力是氢键及范德华力。上述实验结果进一步说明具有类似C6-C3-C6结构的衍生物，其C环上的—OH容易与胰酶关键氨基酸的羰基—COOH形成氢键等非共价键，从而阻止该蛋白酶的生物活性。

5 夏佛塔苷对胰脂肪酶紫外吸收光谱的影响

紫外吸收光谱可直观反映胰脂肪酶中芳香族氨基酸残基Tyr、Trp的变化情况，间接反映夏佛塔苷分子对胰脂肪酶周围残基微环境和其二级结构的影响。由图6可知，随着夏佛塔苷质量浓度的增加，胰脂肪酶在210～280 nm波长处两个紫外吸收峰逐渐增强，其中第一个峰从208 nm向右移至213 nm（红移5 nm），归因于胰脂肪酶蛋白骨架构象的变化；第二个峰从270 nm移到272 nm（红移2 nm），究其原因可能是夏佛塔苷使胰脂肪酶中Tyr、Trp残基发生π→π*跃迁，引起周围微环境疏水性减弱，亲水性变强，极性增大，导致其二级结构改变，再次证明了二者之间的猝灭类型是静态猝灭。

6 夏佛塔苷对胰脂肪酶同步荧光光谱的影响

同步荧光色谱可单独监测波长差在Δ

＝15 nm和Δ

＝60 nm的荧光发射光谱，选择性地呈现Tyr和Trp残基特征荧光信息，从而反映样品分子对蛋白构象的影响。从图7可以看出，随着夏佛塔苷质量浓度的增大，Tyr残基和Trp残基的发射峰形基本保持不变，但强度逐渐减弱，两者的最大发射波长位置均发生红移，分别红移了5 nm和3 nm，荧光猝灭强度分别下降了25.9%和38.3%。这说明夏佛塔苷分子更易影响胰脂肪酶内部Trp残基所处的微环境，使其极性增大，疏水性减弱，亲水性增强，导致胰脂肪酶的二级结构发生了改变，该结果与紫外吸收光谱结果一致。

7 夏佛塔苷对胰脂肪酶三维荧光光谱的影响

三维荧光光谱可以从不同维度描述激发光谱和发射光谱以及荧光强度变化的信息，可进一步直观反映样品小分子对蛋白质的结构及发光基团的微环境的影响。峰a 为瑞利散射峰（激发波长＝发射波长，荧光强度），峰1和峰2分别是多肽骨架结构荧光特征峰及Tyr、Trp残基的荧光特征峰。如图8所示，加入夏佛塔苷后，峰1由（230.0 nm/340.0 nm，2 418）变化为（230.0 nm/342.0 nm，1 803），峰2由（280 nm/341.0 nm，5 509）变化为（280 nm/345 nm，3 675）。即加入夏佛塔苷后，两个发射波长分别红移2 nm和4 nm，荧光强度分别下降25.43%和33.29%，表明两者结合成复合物后，氨基酸的微环境极性增大，疏水性减弱，导致胰脂肪酶构象松散，二级结构解折叠等变化，这与同步荧光光谱和紫外吸收光谱结果一致。此外，随着夏佛塔苷的加入，峰a的荧光强度升高，可能是夏佛塔苷与胰脂肪酶形成复合物后其表面的保护水层分子分散程度减小，分子粒径增大，散射效应增强，导致荧光强度增强。

8 分子对接结果

分子对接技术可以直观地描述酶与抑制剂分子之间结合的构象，从微观角度再现酶与抑制剂分子间的相互作用机制。相关研究发现，胰脂肪酶的催化活性中心是一种由丝氨酸（SER）-组氨酸（HIS）-天冬氨酸（ASP）构成的三联体的模式结构，其具体的催化活性位点是SER153、HIS264、ASP177。根据该模型，采用分子对接技术获得夏佛塔苷与胰脂肪酶的作用位点，如图9所示。经计算，夏佛塔苷分子与该酶的自由结合能为-23.3 kJ/mol。该黄酮类小分子可直接进入酶疏水口袋的空穴（图9A），它的C环4位酮基与其活性中心位点的HIS264结合，形成稳定的夏佛塔苷-胰脂肪酶复合物，符合上述竞争性酶动力学抑制的特点，也间接证实了荧光猝灭过程的分析结果。夏佛塔苷的A环6位葡萄糖苷元和8位阿拉伯糖苷元，分别与酶的氨基酸残基ALA178、HIS264、LEU175、MET217、ILE202、SER266形成常规氢键，与HIS151、PHE215形成π-阳离子相互作用力，与GLY216、PRO177、THR204、THR78形成碳氢键（图9B），共同维持夏佛塔苷与胰脂肪酶复合物的稳定。

结论

采用凝胶层析法对毛竹笋篼提取物进行分离纯化，获得了主要黄酮化合物——夏佛塔苷，并利用质谱对其结构进行鉴定。利用紫外吸收光谱和荧光光谱等多光谱分析了夏佛塔苷对胰脂肪酶的抑制动力学作用及荧光猝灭机理。结果表明，一定质量浓度的夏佛塔苷通过可逆竞争性方式抑制胰脂肪酶，IC50为（76.3±0.12）μg/mL；荧光光谱结果显示夏佛塔苷与胰脂肪酶形成的复合物存在1 个结合位点，它以静态猝灭方式猝灭该蛋白酶的内源荧光；热力学参数反映两者通过氢键和范德华力自发地形成复合物；紫外、同步和三维荧光光谱均显示，夏佛塔苷可使胰脂肪酶中两个主要荧光基团的最大发射波长红移，使其微环境极性增大，疏水性减弱；分子对接结果直观地反映夏佛塔苷分子以氢键、疏水力、范德华力等作用力，竞争性结合胰脂肪酶的催化活性位点，从而抑制其生物活性。以上结果为深度开发毛竹笋篼资源及降脂功能食品提供了一定的理论基础，但其在细胞内和动物体内活性有待进一步验证。

作者简介

通信作者：

贺亮，男，中共党员，研究员，浙江省151人才第二层次人选，硕导，现任省森林资源生物与化学利用重点实验室主任、省林科院森林食品所副所长、国家林业局森林食品资源利用与质量控制重点实验室核心成员、国家林业局竹笋工程技术研究中心核心成员，隶属林业与草原局木本植物多糖创新联盟理事单位。中国菌物学会蛹虫草产业分会副秘书长，中国竹产业协会竹食品与日用品分会常务理事。先后承担国家自然面上基金、青年基金、国家重点研发子课题、省科技厅重大专项及省院合作重大专项等20余项；在国外SCI期刊发表学术论文近30篇，其中中科院二区以上TOP期刊10篇，单篇影响因子7.0，总影响因子大于100，他引率超过180，国内核心20余篇；获国家发明专利20项（第一发明人8项），其中三项发明专利已成功转让；主持及参加完成的项目获中国商业联合会科技进步特等奖1项，省科技进步二等奖2项，地厅级二等奖5项，获省自然科学学术三等奖1项；主持完成的虫草真菌项目累计创森林食品产值超过5个亿，创利税近1亿元，帮助企业获得保健食品批文1项。

第一作者：

夏张晨，女，在读硕士研究生，研究方向为中药功能因子开发。

本文《不同柑橘纤维及添加量对酱牛肉出品率及品质的影响》来源于《食品科学》2025年46卷第11期21-29，作者：夏张晨，孟晓慧，王衍彬，袁少飞，张 建，程俊文，方 茹，陈 敏，贺 亮*。DOI : 10.7506/spkx1002-6630-20240306-040。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：林安琪；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心（动物替代蛋白）及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、四川轻化工大学食品与酿酒工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所（四川省农业科学院食物与营养健康研究所）、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。

长按或微信扫码进行注册

会议招商招展

联系人：杨红；电话：010-83152138；手机：13522179918（微信同号）

为进一步深入探讨食品产业在当前复杂多变环境下的高质量发展路径，并着重关注食品科学、营养安全保障的基础研究与关键技术研发，贯彻落实“大食物观”和“健康中国2030”国家战略，北京食品科学研究院和中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志，将与国际谷物科技协会（ICC）、湖南省食品科学技术学会、湖南省农业科学院农产品加工研究所、湖南农业大学、中南林业科技大学、长沙理工大学、湘潭大学、湖南中医药大学、湖南农业大学长沙现代食品创新研究院共同举办“第十二届食品科学国际年会”。本届年会将于2025年8月9-10日在中国 湖南 长沙召开。

长按或微信扫码进行注册

会议招商招展

联系人：杨红；电话：010-83152138；手机：13522179918（微信同号）