Nature丨系统揭示RNA结合蛋白的组装模式

撰文 | 易

RNA结合蛋白（RBPs）在基因表达的转录后调控中扮演着至关重要的角色，参与RNA的剪接、转运、稳定性调控和翻译等多个关键过程。传统的紫外光诱导交联结合CLIP-seq技术（UVC-CLIP）能够有效鉴定RBP与RNA的直接相互作用，并精确定位其结合位点，为研究RBP功能提供了重要工具。然而，这一方法存在明显的局限性，即无法解析多个RBPs如何在相同的RNA分子上形成多蛋白复合体，也无法揭示这些复合体的动态变化及其功能意义。由于RNA在细胞内通常与多个RBPs协同作用，形成复杂的调控网络，因此理解这些多蛋白组装的机制对于阐明RNA代谢调控的全貌至关重要。因此，亟需开发新的实验方法，以系统性研究RNA依赖的蛋白组装及其在生理和病理条件下的动态调控。

近日，斯坦福大学Paul A. Khavari在Nature期刊上发表题为irCLIP-RNP and Re-CLIP reveal patterns of dynamic protein assemblies on RNA的研究论文，开发了irCLIP-RNP和Re-CLIP两种创新技术，首次系统揭示了RNA结合蛋白在RNA上形成动态多蛋白复合体的分子特征，发现HNRNPC与UPF1等蛋白通过协同结合特定RNA调控基因表达，为理解转录后调控机制提供了新见解。

作者开发了两种互补的实验方法——irCLIP-RNP与Re-CLIP，以系统性研究RNA上的多蛋白组装。

1. irCLIP-RNP：在传统irCLIP技术基础上优化，采用生物素/红外染料标记的3' RNA适配体，结合中等浓度RNase I消化，以保留RNA依赖的蛋白相互作用。通过凝胶电泳分离不同分子量的RNA-蛋白复合物（60–350 kDa），并进行质谱分析，鉴定与目标RBP共价结合的RNA依赖关联蛋白（RDAPs）。

2. Re-CLIP：通过两轮独立的irCLIP免疫沉淀，结合RNA测序，鉴定被多个RBPs同时结合的RNA分子。例如，先免疫沉淀HNRNPC，再分别沉淀ELAVL1、KHSRP或HNRNPM，分析共结合RNA的序列特征。

通过irCLIP-RNP和Re-CLIP技术体系，作者系统揭示了RNA结合蛋白在转录后调控过程中形成的动态多蛋白复合体的分子特征和功能机制。在技术层面，irCLIP-RNP通过优化RNase消化条件和红外标记策略，成功实现了对RNA依赖的蛋白相互作用网络的高分辨率解析。该方法在HEK293T细胞中鉴定出超过360个与目标RBP存在共价交联的潜在相互作用蛋白，其中45个蛋白在高分子量区段（60-350kDa）呈现显著富集。

在机制研究方面，作者重点解析了HNRNPC蛋白的动态调控网络。通过时间分辨的EGF刺激实验，发现19个与mRNA剪接调控密切相关的RDAPs（如UPF1和CSDE1）表现出明显的刺激依赖性结合模式改变。特别值得关注的是，邻近连接实验（PLA）和亚细胞定位分析证实，HNRNPC与UPF1在EGF刺激1小时后在核质区形成显著的共定位，这种相互作用不依赖于蛋白表达量的变化。进一步的基因组学分析揭示，这对互作蛋白协同调控1721个基因的剪接事件，其中内含子保留（RI）事件占显著比例。通过构建minigene报告系统，作者在RND3和RPS9等靶基因上直接验证了HNRNPC-UPF1复合体对选择性剪接的调控功能。

在分子互作层面，结合AlphaFold3结构预测和体外RNA pull-down实验，首次在原子水平解析了HNRNPC-UPF1复合体在靶RNA上的结合特征。结构模型显示，HNRNPC倾向于结合富含尿苷的序列，而UPF1则偏好结合5'-UUG和UUUUG-3'等特征motif。这种特异的结合模式可能解释了复合体对不同靶RNA的选择性识别。此外，通过整合irCLIP-RNP和Re-CLIP数据，发现HNRNPC与不同RDAPs的组合会形成具有不同RNA结合特性的功能模块，这种模块化组装方式可能为细胞提供了灵活调控基因表达的分子基础。

在功能层面，本研究不仅证实了HNRNPC-UPF1复合体在剪接调控中的作用，还发现其参与调控靶RNA的稳定性。mRNA衰减实验显示，在HNRNPC或UPF1敲除后，665个共同调控的剪接变体表现出显著的稳定性改变。这些稳定性受调控的转录本在3'UTR区域富集了HNRNPC-UPF1的结合位点，提示复合体可能通过3'UTR介导的机制影响mRNA降解。

最后，作者还探讨了不同细胞类型对RBP复合体组装的影响。通过比较HEK293T和HepG2细胞中的irCLIP-RNP数据，发现53个RDAPs的组装模式具有显著的细胞类型特异性。例如，在HepG2细胞中，HNRNPU与NONO/SFPQ的相互作用明显增强，这种差异可能与细胞特异的转录组特征或信号通路活性相关。这些发现强调了细胞微环境在塑造RBP功能网络中的重要性，为理解不同细胞类型中基因表达调控的特异性提供了新的思路。

综上所述，本研究不仅建立了研究RNA-蛋白复合体的创新技术平台，还深入揭示了HNRNPC为核心的动态调控网络在基因表达调控中的多重作用机制。这些发现为理解转录后调控的复杂性提供了重要理论基础，也为相关疾病的机制研究和治疗靶点开发提供了新的线索。

https://doi.org/10.1038/s41586-025-08787-5

制版人： 十一

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