Cell Stem Cell丨代谢状态是驱动干细胞胚胎模型中表型变异的关键因素

撰文丨余莉+章台柳

哺乳动物胚胎在子宫内发育，这使得直接观察与操作难以实现。这一研究障碍可通过诱导人或小鼠多能干细胞自组织形成干细胞胚胎模型（SEMs）【1】来克服——这些模型能再现胚胎的诸多分子、细胞和形态学特征。由于SEMs具有易获取、可追踪、易操作及可规模化等优势，研究者能够在统计学显著的样本规模中获得更定量化、更精细的机制解析。然而，此类模型广泛应用面临的主要障碍是其存在显著且难以解释的表型变异，即相同培养条件下出现显著的表型变异，这限制了SEMs在基础与应用研究中的应用潜力。目前，导致这种看似随机变异的生物学机制尚不明确。

近日，来自德国马克斯-普朗克研究所的Jesse V. Veenvliet团队在Cell Stem Cell杂志上发表文章Integrated molecular-phenotypic profiling reveals metabolic control of morphological variation in a stem-cell-based embryo model，通过并行记录模拟胚胎躯干形成的单个结构的转录组状态与形态发育历程，探究表型变异的根源。将整合时间分辨的scRNA-seq和基于成像的表型分析和机器学习算法相结合，鉴定出可预测最终表型的早期特征。利用这一预测能力，发现氧化磷酸化与糖酵解的早期失衡会导致形态异常和神经谱系偏好——这一发现已通过代谢测量验证。基于此，代谢干预有效改善了最终表型状态。研究不仅确立了代谢状态是驱动表型变异的关键因素，更建立了可广泛应用于类器官和SEMs表型变异预测的通用分析框架。该策略可用于识别和控制潜在的生物学过程，从而显著提升研究可重复性。

研究人员首先观察到在干细胞的胚胎躯干发育的分化结局具有差异化。即SEMs经过WNT信号通路激活剂24小时脉冲刺激后，能够自发打破对称性、延伸并自组织形成体轴的小鼠胚胎干细胞（mESC）聚集体，形成类原肠胚（Gastruloids）。当添加细胞外基质成分Matrigel时，类原肠胚可发育成躯干样结构（TLSs），其形态特征与胚胎躯干核心区高度相似。约40%的躯干样结构（TLSs）能像真实胚胎一样成功形成体节和神经管，但约60%的模型仍无法发育出充分分化且有序排列的组织结构。为解析这种变异性的生物学基础，研究人员系统分析了第5天（终末状态）躯干样结构（TLSs）的全谱系表型特征。实验采用携带T::H2B-mCherry（TmCH）和Sox2::H2B-Venus（Sox2VE）双报告系统的小鼠胚胎干细胞（mESCs），通过标记神经中胚层祖细胞（NMPs，TmCH+/Sox2VE+）及其衍生的体节中胚层（TmCH+/Sox2VE-）与神经谱系（Sox2VE+/TmCH-）细胞，实现细胞命运的精准示踪。通过DAPI（细胞核）和鬼笔环肽（纤维状肌动蛋白）染色评估整体结构特征。结果显示，发育异常的结构体积显著小于成功组装的TLSs，主要表现为以下两种表型：（1）神经组织过度增殖且排列紊乱；（2）少数案例中出现神经管异常包裹中胚层组织的"内外翻转"现象（该表型此前在无Matrigel培养的人源躯干类器官中亦有报道）。TmCH+细胞的体积占比与荧光强度均显著降低。与真实胚胎相比，第二种异常表型表现为多体轴形成现象。发育异常的多体轴躯干样结构（TLSs）普遍存在体积较小且TmCH+细胞占比降低的特征。

研究人员推测，终末状态形态差异可能源于早期阶段的细微表型变异。为此，通过宽场成像技术对768个独立结构进行了第2至4天（每24小时）的表型追踪，并结合机器学习进行定量分析。该定量分析完整捕捉到既往报道的三个发育阶段：生长（第2-3天）、延伸（第3天）及极化T表达的建立（第3天后），并发现结构在初始生长阶段（第2-3天）后开始获得更复杂的形态特征（第3天）。并且，表型变异随着时间而增加。与表型分析同时进行scRNA-seq分析来评估基因表达和细胞组成。评估结构间细胞组成与基因表达的变异特征，发现所有时间点的结构间均存在显著细胞组成差异，且这种差异随着时间推移而增大。至第5天时，发育异常与成功的结构在体节细胞和神经细胞占比上呈现显著差异，与基于形态学分类的结果高度一致。综合分析各结构间的高变基因和拟时序分析，发现分子水平变异与表型变异具有同步涌现的特性。随后，研究人员综合以上数据并结合机器学习，鉴定出可预测终末状态的早期表型特征。即成功形成TLSs的结构普遍具备以下三个前期特征：（1）第3-4天TmCH信号强度更高；（2）第4天TmCH+细胞占比更大；（3）第4天核心区相较于外周呈现更强的TmCH信号。就单轴vs多轴形成而言，结构形态特征与TmCH信号的强度/空间分布特征均具有预测效力。

研究人员进一步探究导致分化结局差异的生物学机制，发现糖酵解通路非常重要。即在胚胎躯干形成过程中起关键作用的神经中胚层祖细胞（NMPs），其代谢特征的差异先于终末形态变异出现，且糖酵解活性增强可改善发育结局。对终末状态已知/预测结构的耗氧率（OCR）和糖酵解与三羧酸循环（TCA）代谢物进行测量，发现成功结构呈现以下特征：（1）OCR从第3天到第4天逐渐降低；（2）糖酵解中间产物水平升高；（3）NAD+/NADH与ATP/ADP比值保持稳定。与之相反，发育异常结构表现为：（1）第3天OCR基线水平较低；（2）第3-4天糖酵解中间产物（尤其是6-磷酸果糖[F6P]和6-磷酸葡萄糖[G6P]）含量减少；（3）第3天ATP/ADP与AMP/ATP比值分别小幅下降和上升，但第4天均恢复至正常水平；（4）第3-4天NAD+/NADH与乙酰辅酶A（CoA）水平降低，提示能量代谢障碍与氧化还原失衡。值得注意的是，成功与失败结构间大多数TCA代谢物水平无显著差异。即成功TLSs从第3天到第4天代谢向糖酵解倾斜，同时维持氧化磷酸化（OxPhos）功能；而失败TLSs普遍存在第3天代谢活性低下特征，表现为OCR降低、糖酵解中间产物减少及乙酰辅酶A水平下降。至第4天时，失败结构糖酵解中间产物持续低水平与TCA中间产物正常水平的并存现象，结合OxPhos基因表达上调，提示其存在糖酵解缺陷伴OxPhos代偿性激活。尽管这种代偿部分恢复了能量状态（第4天ATP/ADP与AMP/ATP水平与成功结构相当），但乙酰辅酶A水平仍持续低下。使用线粒体复合物I抑制剂鱼藤酮（该药物可通过抑制OxPhos促进糖酵解）、糖酵解抑制剂2DG等来对代谢状态进行干预，发现通过调节氧化磷酸化（OxPhos）与糖酵解之间的平衡可精准调控TLSs的表型结局。特别对于发育预后最差的结构，促进糖酵解优势能有效纠正其神经谱系偏态。进一步研究表明，代谢状态与形态发生信号通路的双重分化是驱动表型变异的核心机制——其中糖酵解-WNT信号通路的协同激活对平衡体节与神经组织形成、进而实现胚胎躯干模式建成与形态发生具有决定性作用。

总的来说，这项研究通过构建干细胞的胚胎躯干发育模型，系统解析了其中的分子与表型变异的特征谱。通过整合多模态数据并运用机器学习方法，成功鉴定来可预测终末形态的关键特征与生物学过程。并揭示出早期代谢状态通过可调控方式决定分化结局——这一发现为发育调控提供了新的干预靶点。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.stem.2025.03.012

制版人： 十一

参考文献

1. Veenvliet, J.V., Lenne, P.-F., Turner, D.A., Nachman, I., and Trivedi, V. (2021). Sculpting with stem cells: how models of embryo development take shape.Development148, dev192914.

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