上海交大改造大肠杆菌，实现柚皮素的高效合成

柚皮素（Naringenin）是一种广泛存在于柑橘类水果中的黄酮类化合物。研究表明，柚皮素及其类似物（如圣草酚、松属素等）在抗癌、降血糖和心血管保护方面表现出色。例如，它们能够抑制癌细胞增殖、转移和血管生成，对卵巢癌、肝癌和乳腺癌等多种癌症细胞具有显著抑制作用。然而，传统的植物提取法生产效率低、成本高，限制了其大规模应用。

近日，上海交通大学生命科学院肖毅团队在 Journal of Agricultural and Food Chemistry 上发表了一篇题为“Promoter Engineering and Two-Phase Whole-Cell Catalysis Improve the Biosynthesis of Naringenin in E. coli”的研究，研究人员通过启动子工程和两相全细胞催化技术优化了柚皮素及相关产物的合成路径，从而大幅提高了其生产效率，有望实现这种有益化合物的大规模生产。

在柚皮素的生产中，研究团队主要面临两大问题：前体供应不足，柚皮素的合成需要消耗丙二酰辅酶 A（malonyl-CoA），而这一前体在微生物细胞内含量有限，且容易被脂肪酸合成途径竞争利用；细胞毒性，即柚皮素本身具有抗菌性，当其浓度超过 100 mg/L 时，会抑制宿主细胞的生长和代谢，进而影响产量。

为了解决前体供应问题，研究团队决定在工程菌株中，过表达乙酰辅酶 A 羧化酶（ACC）。作为催化乙酰辅酶 A 转化为丙二酰辅酶 A 的关键酶，其过表达能够增加丙二酰辅酶 A 的供应。然而结果表明过度表达 ACC 会导致细胞代谢负担加重，甚至引发蛋白质的丙二酰化修饰，反而抑制细胞生长。

因此，研究人员设计了一种精细调控策略——启动子工程。他们以 T7 启动子为基础，通过随机突变构建了两个启动子文库（acc-N2 和 acc-N5），并分别针对启动子的结合域和起始域进行修饰。随后，利用丙二酰辅酶 A 传感器（基于 FapR 转录因子）筛选出荧光信号强且细胞生长良好的菌株。经过两轮荧光筛选，他们从 357 个菌落中挑选出了 6 个表现优异的菌株。这些菌株中，像 N2-14 和 N5-22，其发酵性能明显提升。

特别是携带 N2-14 启动子的菌株，在柚皮素产量上比原始菌株提高了 62%，达到 277.5 mg/L，同时细胞生长未受显著影响。这一成果表明，启动子工程能够平衡前体供应与细胞代谢负担，是实现高效生产的关键技术之一。

尽管启动子工程提高了产量，但柚皮素的细胞毒性问题依然存在。因此，研究团队引入了两相全细胞催化技术。该技术的核心是通过有机溶剂将柚皮素从水相中萃取出来，从而降低其对细胞的毒性。研究人员测试了六种有机溶剂（如 1-癸醇、十六烷等），最终发现肉豆蔻酸异丙酯（isopropyl myristate）表现最佳。它不仅具有良好的生物相容性，还能选择性富集柚皮素，而底物对香豆酸则主要保留在水相中。通过优化溶剂比例（15% v/v）和细胞密度，柚皮素的产量进一步提升至 230.9 mg/L，生产速率达到 57.7 mg/L/h。值得注意的是，在放大实验中，研究人员还采用了“有机相转移”策略，即将第一轮催化后的有机相加入新鲜催化系统进行第二轮反应。这一方法最终使柚皮素总产量飙升至 3001.7 mg/L，转化率高达 61.1%，这一产量相比之前有了大幅提升，让微生物生产柚皮素更具实际应用价值。

此外，除了生产技术的突破，研究团队还测试了柚皮素及其类似物的抗癌活性。实验选取了五种癌细胞系（如卵巢癌 ID8、肝癌 HepG2 等），发现柚皮素和其类似物高圣草酚（homoeriodictyol）均能显著抑制癌细胞增殖。尤其是高圣草酚，对结肠癌 MC38 细胞的抑制率高达 83.9%，甚至优于柚皮素（54.4%）这表明这些黄酮类化合物在抗癌领域有着巨大的开发潜力。

图 | 柚皮素及其类似物提取物抗癌活性的测试流程,展现良好抗癌潜力

总之，这项研究通过启动子工程和两相全细胞催化技术。为柚皮素的生物合成提供了高效策略的同时，也揭示了柚皮素及其类似物的抗癌活性，为新型抗癌药物的研发提供了新方向。相信未来随着研究的深入，或许会有更多基于微生物合成的天然产物应用于医疗、食品等领域，为人类健康和生活带来福祉。

参考文献：

1.https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.5c00892

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