动物行为实验指南丨啮齿动物迷宫箱测试（Puzzle Box Test）方法

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《动物行为实验指南》共674页，涵盖了常见的实验动物，如小鼠、大鼠和斑马鱼，详细描述了每一种行为测试的实验设计、测试设备、实验流程、评估指标、预期结果、常见问题及解决方法、数据分析、模型应用与局限性等各个方面。它通过快速引导，帮助研究人员高效地掌握实验的每个阶段，减少了查阅文献和寻找方法的时间，成为各类科研人员的重要参考资料。 《动物行为实验指南》共计收录了16种动物行为类型，包括焦虑抑郁、学习记忆、痛觉、运动、恐惧、社交、癫痫、操作、成瘾、视觉、痒觉、味觉、嗅觉、睡眠、斑马鱼行为以及常见动物模型等内容。每一类动物行为下，都详细介绍了多个经典的实验范式，涵盖了超过100种实验方法。 www.behaviewer.com

环境丰富化能够极大地影响神经回路的发育和功能。此外，研究表明，在亨廷顿病模型中，环境丰富化成功地延缓了症状的发作，这表明环境因素能够对神经退行性疾病中所观察到的进行性细胞层面损伤起到神经保护作用。然而，使动物所处环境丰富化的方式可能存在很大差异。而且，目前还没有一种简单直接的方法来评估环境丰富化的效果。与在标准实验室条件下饲养的小鼠群体相比，迷宫箱测试（Puzzle Box Test）是一种可靠的手段，用于确定增加社交、感觉和运动刺激对小鼠的有效性。这是一种快速但非常可靠的用于测试高阶认知功能的方法。该范式是一种用于评估实验动物，特别是小鼠认知能力和问题解决技巧的行为学实验。在这种测试中，小鼠被放置在一个设计复杂的盒子或容器内，该环境设置有特定的障碍物、隐藏的食物奖励或其他目标物品。小鼠必须通过探索和学习来找到出口或获取奖励。这种测试常用于神经科学领域，以研究学习与记忆、认知功能以及相关脑区的作用。这项简单的解决问题任务利用了啮齿动物天生的本能，即它们渴望通过寻找遮蔽处来避开开阔的空间。通过在遮蔽处的入口设置越来越复杂的障碍物来评估认知能力。特定的受试小鼠成功移除障碍物并进入遮蔽处所需的时间，是衡量其任务表现的主要指标。这种方法能够提供一种可靠的方式，快速评估不同环境丰富化方案对认知功能的有效性。

1. 饲养环境（丰富化程度）：

获取4只处于妊娠后期的成年雌性小鼠。随机将其中2只分配到标准饲养环境中，把每只小鼠分别放入一个干净的标准小鼠笼（整体尺寸为391×199×160毫米），笼内放置一个红色的小鼠圆顶小窝。对于丰富化饲养环境，将剩下的2只小鼠放入一个干净的大鼠尺寸的笼子中（整体尺寸为462×403×404毫米）。在丰富化饲养笼中，放置各种旨在增加感觉和运动刺激的物品（例如跑轮、视觉刺激物、带气味的棉球、魔术贴条）。每2到3天在笼内移动这些物品；如有物品损坏则及时更换。

在小鼠出生21天断奶后，对小鼠进行性别鉴定，然后根据它们所生长的环境条件，将它们分性别饲养在相应环境中，即雄性和雌性分开饲养。对于丰富化饲养环境，要确保每个笼子里有3到10只小鼠，而标准饲养环境下每个笼子有2到5只小鼠。一旦小鼠成年（12至14周龄），就开始进行行为测试。

2. 迷宫箱的制作

获取6块白色丙烯酸板（或其他无孔材料）：一块尺寸为750×280毫米，两块尺寸为280×250毫米，两块尺寸为750×250毫米，还有一块尺寸为150×280毫米（见图1）。用750×280毫米的那块板作为迷箱的底部，用280×250毫米的板作为迷箱的两端，用750×250毫米的板作为迷箱的侧面。从迷箱的一端向箱内测量150毫米的距离，然后将那块黑色丙烯酸板横跨迷箱放置，这样就把迷箱分隔成了两个隔间（一个大隔间，一个小隔间），且开口与迷箱底部齐平。取那块150×280毫米的白色丙烯酸板，将其放置在迷箱的小隔间上方，确保完全覆盖住这个区域，从而形成一个黑暗的“目标箱”隔间。用铰链将这块丙烯酸板固定在主箱体上，或者在进行行为测试时将其完全取下。取3块丙烯酸板（每块尺寸为4×120毫米），将它们拼接成一个“U形”通道。

Fig1 迷箱任务示意图

迷宫箱是一个丙烯酸材质的箱子，由一个开阔区域（600×280毫米）和一个有遮蔽的目标箱区域（150×280毫米）组成，整体尺寸为750×280毫米。分隔这两个区域的隔板（灰色）上有一个40×40毫米的开口，动物可以通过这个开口从开阔区域进入有遮蔽的目标箱区域。随着测试的推进，这个开口会被障碍物堵住，而且这些障碍物越来越难以移除。动物要经历一个为期五天的实验流程，该流程包含四种障碍物设置条件，每种条件下进行三次测试。

3. 迷宫箱任务的实施

用70%的酒精彻底清洁迷箱。在每只受试小鼠测试之间都要重复这一步骤。

在迷箱的目标箱区域放置一个干净的红色小鼠圆顶小窝，然后盖上目标箱的盖子。

如果正在测试某一障碍物条件，将障碍物放置在目标箱的门口处。将受试小鼠放入迷箱的开阔区域，使其面朝目标箱，并且位于离目标箱最远的一端。记录小鼠的四只爪子都进入迷箱目标箱区域所用的时间。如果小鼠没有进入目标箱，一旦达到设定的时间限制就终止测试。测试结束后，将小鼠从迷箱中取出，放入一个单独的暂养笼中，直到下一次测试开始。每只小鼠的每次测试之间要间隔60到180秒。

对于每只小鼠，连续五天进行测试，每天进行三次测试，共有四种障碍物条件，每种条件下测试三次。对于某一特定的障碍物条件，其第三次测试应总是安排在第二天进行。

迷箱任务持续进行五天，包含四种障碍物条件。在前四天，每天进行三次测试，而在第五天进行一次测试。每种障碍物条件下都要进行三次测试；前两次在同一天进行，第三次则在紧接着的第二天进行。

某一障碍物条件下的第一次测试旨在检验受试动物原本的解决问题能力，第二次测试考察的是受试动物对任务的掌握情况以及强化效果，而第三次测试则用作对受试动物解决问题方法的记忆保持和回想能力的测定。

Fig2 迷箱任务中的障碍物条件

迷箱区域以及障碍物条件的示意图如下。（A）条件0（C0），在开阔区域和目标箱区域之间的门口处不存在障碍物。（B）条件1（C1），在开阔区域和目标箱区域之间的门口处放置有一个“U形”通道。（C）条件2（C2），此时“U形”通道内填充有干净的垫料。（D）条件3（C3），在开阔区域和目标箱区域之间的门口处放置有一个“纸巾塞”。（E）条件4（C4），在开阔区域和目标箱区域之间的门口处放置有一个“泡沫塞”。

评估参数

数据可表示为完成测试所用的时间（包括那些动物在规定时间限制内未完成任务的无效测试情况），或者表示为无效测试的次数。

完成任务时间：

是最主要的评估参数，记录小鼠从被放入迷箱的开阔区域开始，到其四只爪子都进入目标箱区域所花费的时间。

不同障碍物条件下的表现：

迷箱测试设置了多种障碍物条件，如 C0（无障碍物）、C1（U 形通道）、C2（通道填充垫料）、C3（纸巾塞）、C4（泡沫塞）等。通过观察小鼠在不同障碍物条件下的表现，可以更细致地评估其认知灵活性和适应能力。如果小鼠在难度逐渐增加的障碍物前，完成任务的时间变化情况、是否能够成功通过等，都能反映出它应对不同挑战的能力。在某些条件下，丰富化环境饲养的小鼠优势更明显，说明这种环境可能增强了小鼠应对复杂情况的能力。

试验次数对应的表现变化：

每个障碍物条件通常会进行多次试验，如前两次在一天进行，第三次在次日进行。第一次试验可反映小鼠原本的问题解决能力，第二次试验考察对任务的学习和强化效果，第三次试验评估对解决方法的记忆和回想能力。通过分析小鼠在不同试验次数下的表现变化，能了解其学习和记忆能力。若小鼠在第二次试验时完成时间明显缩短，说明它能够快速学习和掌握通过当前障碍物的方法；若第三次试验时表现依然良好，说明其对解决方法有较好的记忆保持。

无效试验次数：

如果小鼠在设定的时间限制内没有完成任务，即未进入目标箱，此次试验记为无效试验。无效试验的次数可以作为一个评估参数，反映小鼠在面对困难时的坚持程度以及解决问题的能力下限。无效试验次数较多，可能意味着小鼠在该测试中存在较大困难，其认知或行动能力相对较弱。

Fig3 结果分析示例

在丰富化环境中饲养的小鼠在迷宫箱中解决障碍物任务所用的时间，显著少于在标准环境中饲养的小鼠。在迷箱测试的各个单独试验中都观察到了丰富化环境（EE）对小鼠表现的这种影响，在丰富化环境中饲养的小鼠解决每个单独的障碍物谜题所需的时间显著更少，并且在每种条件下的第一次试验中这种差异尤为明显。在丰富化环境中饲养的小鼠比在标准环境中饲养的小鼠能更快地完成迷箱任务。对于从出生起就在丰富化环境或标准环境中饲养的成年小鼠，其在迷箱任务中的表现是通过小鼠的四只爪子全部进入目标箱区域所用的时间（以秒为单位）来衡量的。在丰富化环境中饲养的小鼠（红色）在迷宫箱中解决障碍物任务的速度明显快于在标准环境中饲养的小鼠（蓝色）。在各个单独的障碍物谜题任务中，也观察到在丰富化环境中饲养的小鼠群体表现更优。C0：无障碍物；C1：U 形通道；C2：通道内填充垫料；C3：纸巾塞；C4：泡沫塞。

文献引用：

• O'Connor AM, Burton TJ, Leamey CA, Sawatari A. The use of the puzzle box as a means of assessing the efficacy of environmental enrichment. J Vis Exp. 2014 Dec 29;(94):52225.

• Ben Abdallah NM, Fuss J, Trusel M, Galsworthy MJ, Bobsin K, Colacicco G, Deacon RM, Riva MA, Kellendonk C, Sprengel R, Lipp HP, Gass P. The puzzle box as a simple and efficient behavioral test for exploring impairments of general cognition and executive functions in mouse models of schizophrenia. Exp Neurol. 2011 Jan;227(1):42-52.

• Eltokhi, A., Kurpiers, B. & Pitzer, C. Behavioral tests assessing neuropsychiatric phenotypes in adolescent mice reveal strain- and sex-specific effects. Sci Rep 10, 11263 (2020).

• Crinella, F.M., Yu, J. (1995). Brain mechanisms in Problem Solving and Intelligence: A Replication and Extension. Intelligence 21, 225–246.

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• Chance, P. (1999). Thorndike’s Puzzle Boxes and the Origins of the Experimental Analysis of Behavior. Journal of the Experimental Analysis of Behavior 72(3): 433–440.