Cell | 亓磊/W.E.Moerner/朱彦宇团队开发高分辨率活细胞DNA动态成像技术Oligo-LiveFISH

我们常说“我的DNA动了”， 以此来形容对某人某事某物产生的强烈共鸣，仿佛基因里都刻着一份认同感。然而在真实的生命系统中，DNA分子在不同时间尺度下的运动状态，却远比文学隐喻复杂，而我们也知之甚少。真核生物染色体的三维结构和动态变化在调控基因转录和细胞功能中起着至关重要的作用。癌症、神经系统疾病、发育异常等许多疾病的发病机制，往往与三维基因组结构异常有关。然而，由于缺乏在活细胞中实时标记和追踪非重复基因组区域的可靠方法，三维基因组的动态变化及其与基因表达的因果关系这一关键科学问题至今仍不明确。

人类的基因组将展开后线性长度为2 m的DNA压缩折叠至直径不足10微米的细胞核内，而其中包含了2万多个基因和大量的调控元件。这种折叠引发了一系列亟待解答的科学问题。比如这种折叠是如何实现的？其与基因表达有何关系？这些调控元件如何对远距离的特定靶向基因进行精准调控？染色质的动态变化与表观遗传修饰和转录活动有何关系？要破解这些生命暗码，需要整合成像，测序，计算，CRISPR扰动与物理建模等诸多技术。

传统的成像方法如荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）和测序技术（3C、4C、5C、Hi-C）绘制了基因组范围内的染色质互作图谱，揭示了不同尺度下的静态的三维染色质结构如染色质环 (chromatin loops)、拓扑关联结构域（topologically associating domains,TADs）和染色体区室（chromatin compartments）。然而，除了这些静态结构外，染色质的动态变化，不同DNA位点之间的动态相互作用对理解基因组功能和许多生物学过程如基因转录、DNA损伤修复和表观遗传重塑至关重要。即我们不仅需要了解DNA的一维序列信息，也需要了解其三维结构，同时还需要了解三维结构随着时间如何变化，即在加上第四个维度时间。然而，对活细胞中的DNA， 尤其是对非重复基因序列进行实时标记和追踪并非易事。

在活细胞中对特定染色质区域进行成像需要满足以下条件：一是招募足够的荧光标记以实现高信噪比（signal-to-noise ratio，SNR），同时保持染色质结构的完整性；二是需要足够高的时空分辨率以捕捉染色质动态变化。早期的活细胞成像系统通过在特定基因组区域插入外源的序列（如LacO），并利用LacI-GFP结合这些序列来富集荧光信号进行活细胞成像。然而，这种方法通常需要繁琐的基因组插入操作来构建稳定细胞系，且引入的外源标签（约10kb）可能破坏天然的染色质结构和功能。CRISPR不仅是一种强大的基因编辑技术。将CRISRP系统引入荧光标记，同时基于sgRNA的序列特异性识别能力并利用核酸酶失活的Cas9蛋白dCas9（nuclease-dead Cas9，dCas9），CRISPR也提供了对活细胞中的特定位点的染色质进行实时成像的平台。

斯坦福大学的亓磊 (Lei Stanley Qi) 团队曾在2019年开发了一种活细胞FISH（live-cell FISH, LiveFISH）方法【1】。该技术将体外组装的荧光核糖核蛋白（fluorescent ribonucleoproteins,fRNPs）递送至细胞内实现DNA动态成像。这些fRNPs包含三个组分：核酸酶失活的dCas9蛋白；含有靶DNA互补序列的，包含荧光标记的CRISPR RNA（crRNA），以及trans-acting crRNA（tracrRNA）。其中，tracrRNA与crRNA碱基配对形成dCas9可识别的RNA结构（亦可由一条单链向导RNA（single-guide RNA, sgRNA）替代）。虽然LiveFISH能在多种细胞类型中实时观测染色质动态，但由于信噪比的限制，该技术仅适用于对重复基因组区域进行成像。

由于增强子 (enhancer)、启动子 (promoter) 等许多关键的基因组元件多为非重复序列，这一局限性极大限制了3D染色质组织结构的研究。近年来发展的一系列对非重复基因序列的成像方法虽取得进展，但依然面临诸多挑战， 比如信噪比不足，需要构建稳定的细胞系，或是依赖调控多个质粒的表达，且难以应用于原代细胞。

2025年4月15日，斯坦福大学的亓磊和W.E.Moerner团队在

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具体而言，Oligo-LiveFISH将计算机设计生成的靶向基因组位点的DNA寡核苷酸库进行体外转录（in vitro transcription, IVT）得到crRNA库或sgRNA库。crRNA库与一个通用荧光标记的tracrRNA结合，形成crRNA:dye-tracrRNA复合体 ，从而避免对每一个crRNA进行标记。同时结合后的crRNA:dye-tracrRNA比crRNA更加稳定。对于sgRNA库，作者探索了一系列化学标记方法，最终采用点击化学的方法对其进行高效荧光标记和纯化。纯化后的 crRNA:dye-tracrRNA库或者sgRNA库在体外与纯化的dCas9 蛋白组装为fRNPs并通过电转的方法递送至细胞内进行成像。

信噪比（signal-to-noise ratio，SNR）， 信号背景比（signal-to-background ratio，SBR），和信号背景噪声比（signal-to-background-noise ratio,SBN)是信号分析中常用的参量。然而在DNA成像领域这些概念经常被误用。作者对比了SNR，SBR和SBN这些概念，并以SNR和检测效率作为表征成像效率的关键参数。利用机器学习，作者分析了一系列gRNA参数（比如gRNA探针数目，GC 含量，长度，二级结构）和染色质特征（如ATAC-seq, H3K27ac，H3K4me1强度）对成像效率的影响。作者发现gRNA探针数量和染色质可及性 (chromatin accessibility) 是影响DNA成像效率的最关键参数, 并以此建立了可视化不同细胞类型中的各种基因组位点的gRNA设计原则。作者以此原则设计了探针对不同染色体上的非重复基因组位点进行了观测，以此测试了Oligo-LiveFISH技术的普适性。为便于研究者使用，作者开发了gRNA探针设计平台（https://oligo-livefish.org/ ）。

相较于其他基于CRISPR的成像技术，Oligo-LiveFISH的一个独特优势在于无需构建稳定的细胞系，因此可直接应用于原代细胞。基于此优势，作者利用Oligo-LiveFISH实现了对人原代T细胞 (primary T cell) 和人胚胎干细胞 (human embryonic stem cell, hESC) 诱导的神经元细胞 (induced neurons, iNs) 的DNA活细胞成像。而此前对此类细胞的DNA进行活细胞成像是非常困难的。

得益于其能提供单细胞水平的信息，显微镜成像技术一直是生物学研究的重要手段。然而传统光学显微镜受限于衍射极限（diffraction limit ，DL），无法分辨间距小于约250纳米的物体。然而，对于稀疏分布的发光体（如单个荧光分子），通过将发光体的测量强度分布拟合为合适的函数（例如二维高斯函数），其定位不确定度（10-20纳米）可显著低于衍射极限（200-300纳米）。这种方法被称为超定位（super-localization, SL）显微技术。

作者进一步将Oligo-LiveFISH与三维超定位显微镜（3D super-localization microscopy）技术结合，以高空间分辨率（20纳米）和时间分辨率（50毫秒）追踪了非重复基因组区域，发现其染色质运动呈现高度sub-diffusion特性，符合分数布朗运动模型 (fractional Brownian motion, fBM)。此处所用的是由Moerner组开发的双螺旋点扩散函数（double-helix point spread function，DHPSF）显微镜【3, 4】。该技术通过光学工程生成双光斑，利用两个光斑之间的角度代表轴向位置，从而能够以高时空分辨率实现同步追踪三维运动。

作者对3号染色体（Chr3）上的不同间隔距离的四个位点进行多色成像，发现其存在两种构象态。若基因组距离（genomic distance）短的位点对（proximal pair）所对应的三维空间距离 (3D spatial distance) 小于基因组远距位点对 (distal pair) 的三维空间距离时 ，则该染色体处于常规组 (canonical group)。反之则称为变体组 (variant group) 。二者大致以2: 1概率出现。常规组的染色体结构符合Rouse 聚合物模型。

染色质位点的运动并非独立。染色质分离、重组和转录等生物过程需要不同位点之间的动态沟通以实现协调作用【5】。为解析染色质位点间的动态协调机制，作者提出DNA通讯时间（DNA communication time）这一概念，即同一染色体上两个位点通过应力传递感知彼此运动的时间延迟。通过速度互相关分析（velocity cross-correlation, VCC）与动态建模， 作者量化了常规组与变体组的不同位点之间的动态关联，进而提出了两种DNA动态相互作用模式：一维顺式通讯（1D cis-communication）和三维反式通讯（3D trans-communication）。一维顺式通讯通过DNA聚合物链段的弹性行为传递信息。该模式主导短程（<300 kb）相互作用，其动力学行为可通过Rouse模型精确预测。相比之下，三维反式通讯在长距离（>1Mb）时显著存在，其允许位点绕过DNA链，通过桥接复合物在三维空间下加速通讯。两种模式协同作用，使得细胞能动态调控染色质相互作用。Oligo-LiveFISH的单细胞动态数据不仅与Hi-C的结果一致，同时提供了传统测序技术无法捕捉的实时动态信息。

增强子-启动子相互作用在基因转录中扮演重要角色。但增强子如何动态地与目标启动子相互作用，及其与基因转录的关联，目前仍不明确。作者利用Oligo-LiveFISH技术研究了FOS基因转录与其增强子-启动子动态行为之间的关联。研究发现FOS基因转录时，不仅其增强子和启动子之间的3D三维空间距离减小，约束性增加， 并且运动变慢，形成一种更稳定的相互作用。 这一现象可能源于在转录过程中，转录因子和RNA聚合酶的募集增加了染色质微环境的拥挤程度。

展望未来，Oligo-LiveFISH作为一种活细胞DNA成像技术，可用于观测各个时间尺度下，许多细胞类型，尤其是以前难以观测的原代细胞中染色体的动态变化，有望在基因调控机制，发育与疾病的诸多领域实现突破性发现。比如可用其观测细胞分化过程中染色体的动态变化，检测病人细胞中的染色体差异从而揭示疾病的机理。将Oligo-LiveFISH技术与CRISPR干扰/激活（CRISPR i/a）、表观遗传编辑等扰动技术相结合，有望解析增强子-启动子动态与转录调控及表观遗传修饰之间的因果关系。

本文第一作者朱彦宇博士本科毕业于北京大学化学与分子工程学院，博士毕业于威斯康星麦迪逊大学化学系物理化学专业。通讯作者为斯坦福大学生物工程系的亓磊教授和斯坦福大学化学系的W.E.Moerner教授。

https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(25)00350-2

制版人： 十一

参考文献

1. Wang, H., et al., CRISPR-mediated live imaging of genome editing and transcription.Science2019,365 (6459), 1301, DOI: 10.1126/science.aax7852.

2. Zhu, Y., et al., High-resolution dynamic imaging of chromatin DNA communication using Oligo-LiveFISH.Cell2025, DOI: 10.1016/j.cell.2025.03.032.

3. Pavani, S. R., et al., Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function.Proc Natl Acad Sci U S A2009,106 (9), 2995, DOI: 10.1073/pnas.0900245106.

4. Gustavsson, A. K., et al., Fast and parallel nanoscale three-dimensional tracking of heterogeneous mammalian chromatin dynamics.Mol Biol Cell2022,33 (6), ar47, DOI: 10.1091/mbc.E21-10-0514.

5. Lampo, T. J., et al., Physical Modeling of Dynamic Coupling between Chromosomal Loci.Biophysical Journal2016,110 (2), 338, DOI: 10.1016/j.bpj.2015.11.3520.

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