Cell | CRISPR基因编辑递送新突破，新型核质穿梭体系ENVLPE有效提升RNP包装递送能力

撰文 | 木兰之枻

CRISPR基因编辑及各类衍生技术如碱基编辑（base editor）和先导编辑（prime editor）让多种致病遗传变异的精准修复成为可能，展现出了广阔的临床转化应用前景。尽管如此， CRISPR相关基因编辑技术仍面临有效递送的难题，极大限制了其在临床转化中的应用（）【1】。近年来腺相关病毒（AAV）载体及脂质纳米颗粒（LNP）为代表的非病毒类载体研究飞速发展，这让基因编辑体内高效递送成为可能。此外，兼具病毒/非病毒载体优势的病毒样颗粒（VLP）递送技术也不断突破，基因编辑体内递送的效率和安全性也进一步提升（详见BioArt报道：；；）【2-6】。与DNA为基础的递送技术相比，通过递送mRNA或核糖核酸蛋白（RNP）复合物实现基因编辑治疗的VLP技术可通过基因编辑工具的瞬时表达实现致病遗传变异的持久修复，有望实现疗效和安全性的双重保障，因此吸引了众多研究者的关注。

近日，德国合成生物医学研究所/慕尼黑工业大学Dong-Jiunn Jeffery Truong实验室与Gil Gregor Westmeyer实验室合作在Cell杂志上发表了题为Engineered nucleocytosolic vehicles for loading of programmable editors的论文。文章以慢病毒结构蛋白Gag为基础进行多重改造优化，通过整合核质穿梭体系、RNA适配体系统PCP-PP7和（pe）gRNA防降解策略开发出了VLP包装新体系ENVLPE。ENVLPE可高效富集并递送功能性基因编辑RNP复合物， 最终实现了在各类细胞和小鼠体内的高效精准编辑。

CRISPR基因编辑效率取决于Cas9融合蛋白和（pe）gRNA形成的功能性RNP复合物。为此研究者在慢病毒结构蛋白Gag和（pe）gRNA茎环分别添加PCP和PP7元件，利用RNA适配体富集体系PCP-PP7实现了慢病毒颗粒组装时对功能性RNP的富集。此外，考虑到慢病毒颗粒组装主要发生在细胞质中，而（pe）gRNA主要在细胞核内合成，研究者在Gag结构蛋白中进一步增加核质穿梭信号NLS-NES以提升病毒颗粒对功能性RNP复合物的富集和包装效率（图1）。诸多改造之后，研究者通过共表达野生型Gag/Gag-PolD64V蛋白成功构建VLP组装新体系ENVLPE。研究者以先导编辑器PE为递送对象，在HEK293T细胞中利用荧光报告系统开展研究，证实了新体系递送RNP复合物实现精准编辑的可行性和有效性。此外，ENVLPE还能高效递送Cas9 RNP复合物并实现同源重组介导的精准修复。ENVLPE同样能有效递送CRISPR激活系统（CRISPRa）和碱基编辑系统（BE）以实现靶基因的转录激活和单碱基精准编辑。

图1 VLP包装新体系ENVLPE示意图

前期研究指出，先导编辑器PE的pegRNA半衰期短，这会导致整体编辑效率降低。研究者发现，在pegRNA现有3’末端保护元件evo-preQ1的基础上，进一步增加Csy4蛋白结合元件C4，同时在ENVLPE体系中共表达Csy4蛋白，可进一步提升VLP对PE编辑器功能性RNP复合物的富集和递送能力。

现有的VLP组装递送体系依赖慢病毒体系的Gag/Gag-Pol蛋白，特别是需要Pol蛋白酶结构域以实现蛋白水解和基因编辑组分的释放。ENVLPE体系借助RNA适配体系统实现基因编辑组分的富集和包装，因此慢病毒系统的Gag/Gag-Pol并非关键组分。研究发现，ENVLPE体系中删除Gag/Gag-PolD64V组分仅部分降低基因编辑组分的递送效率。此外，进一步替换ENVLPE核心组分中的非必须元件，如利用GCN4替代Gag，用磷脂酶PH结构域替代MY信号域，研究者开发出了仅含13%野生型慢病毒Gag序列的miniENVLPE体系，且仍保留基因编辑组分的高效递送能力。

通过进一步整合ENVLPE和miniENVLPE体系，特别是将miniENVLPE体系的GCN4元件整合至ENVLPE体系，研究者开发出了富集和递送效率更高的新体系ENVLPE+。通过比较ENVLPE+与经典eVLP体系在先导编辑器PE功能性RNP富集、递送和编辑效率各方面的差异，研究者发现ENVLPE+体系在RNP富集和递送等多方面优于eVLP体系。

最后研究者利用ENVLPE+体系递送碱基编辑器的RNP复合物，成功的在原代T细胞中实现了内源基因B2M、TRBC1/2的高效精准编辑。研究者还在两种失明小鼠模型rd6和rd12中利用先导编辑器PE开展基因治疗研究，发现ENVLPE+制备的类病毒颗粒能有效修复Mfrp基因的4bp缺失和Rpe65基因的无义点突变，最终改善了小鼠的视力缺陷，证实了ENVLPE+体系在高效递送基因编辑组分实现临床转化应用的潜力。

总体而言，本研究以慢病毒结构蛋白Gag为基础，通过创新性的多系统整合重组与功能优化，成功开发出了基因编辑递送新体系ENVLPE。新体系优化了类病毒颗粒富集组装系统，实现了功能性RNP复合物在细胞和动物体内的高效安全递送，更在原代T细胞和失明小鼠疾病模型中展现出高效的精准编辑效能和治疗效果。该体系的建立为基因编辑技术的高效递送提供了兼具高效性与安全性的解决方案，具有非常重要的临床转化价值。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.03.015

制版人： 十一

参考文献

1. van Haasteren, J., Li, J., Scheideler, O.J. et al. The delivery challenge: fulfilling the promise of therapeutic genome editing.Nat Biotechnol38, 845–855 (2020).

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3. Yin, D., Ling, S., Wang, D. et al. Targeting herpes simplex virus with CRISPR–Cas9 cures herpetic stromal keratitis in mice.Nat Biotechnol39, 567–577 (2021).

4. Segel, M. et al. Mammalian retrovirus-like protein PEG10 packages its own mRNA and can be pseudotyped for mRNA delivery.Science373, 882–889 (2021).

5. Banskota, S. et al. (2022). Engineered virus-like particles for efficient in vivo delivery of therapeutic proteins.Cell185, 250–265.e16.

6. Mangeot, P.E., et al. (2019). Genome editing in primary cells and in vivo using viral-derived Nanoblades loaded with Cas9-sgRNA ribonucleoproteins.Nat. Commun.10, 45.

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