Cancer Cell | 突破抗原低表达困境：ALA-CART平台重塑CAR T细胞疗法的未来

撰文 | 咸姐

嵌合抗原受体T细胞（CAR T细胞）疗法是一种通过改造患者自身T细胞以增强其抗肿瘤能力的免疫治疗技术。近年来，CAR T细胞疗法在治疗复发/难治性急性淋巴细胞白血病（B-ALL）方面取得了显著的临床效果，缓解率高达70%至90%。然而，CAR T细胞疗法的长期疗效仍面临挑战，主要问题是白血病的复发。复发的原因主要有两个方面：一是CAR T细胞在体内的持久性不足，导致白血病细胞重新出现；二是白血病细胞表面抗原的丢失或低表达，使得CAR T细胞无法有效识别和攻击这些细胞【1.2】。

针对抗原丢失的问题，研究者们开发了多种靶向不同抗原的CAR T细胞产品。例如，CD19靶向的CAR T细胞在治疗B-ALL中表现出色，但许多患者在治疗后出现CD19阴性复发。为了克服这一问题，CD22靶向的CAR T细胞产品被开发出来，其中一种名为CD22BBz的CAR T细胞在临床试验中诱导了70%的患者完全缓解。然而，大多数患者最终因白血病细胞CD22表达降低而复发。这一现象不仅出现在CD22靶向的CAR T细胞治疗中，其他靶向CD19、CD20、ALK和B7-H3等抗原的CAR T细胞也表现出类似的趋势，即在抗原低表达的情况下活性降低。这表明，对低抗原密度的敏感性不足是第二代CAR T细胞设计的内在缺陷，限制了CAR T细胞疗法的长期临床效果【3,4】。此外，CAR T细胞的功能、增殖和持久性依赖于复杂的信号传导网络。尽管第二代CAR T细胞能够利用这些网络驱动T细胞激活，但与传统T细胞相比，CAR T细胞的信号传导存在差异，这可能是其对低抗原密度敏感性较低的原因。因此，如何提高CAR T细胞对低抗原表达细胞的敏感性以及增强其在体内的持久性，成为当前CAR T细胞疗法研究的重要方向。而恢复CAR T细胞在低抗原刺激下的信号传导能力，尤其是增强LAT（T细胞激活连接蛋白）的活性，可能成为提高CAR T细胞疗法长期疗效的关键策略。

近日，来自美国科罗拉多大学安舒茨医学院的M. Eric Kohler团队在Cancer Cell上在线发表题为Restoration of LAT activity improves CAR T cell sensitivity and persistence in response to antigen-low acute lymphoblastic leukemia的文章，证明低抗原表达的白血病会引发第二代CAR T细胞中LAT激活不足，通过设计一种新型的辅助性LAT激活CAR T细胞（ALA-CART）平台，成功恢复了CAR T细胞中LAT的活性，进而增强CAR T细胞对低抗原表达白血病细胞的敏感性、疗效和持久性，从而克服了导致CAR T细胞治疗后复发的多种机制。

为了确定CD22低表达的白血病细胞（CD22-low）对CD22BBz CAT T细胞反应减弱的机制，本文研究人员使用了稳定同位素标记（SILAC）结合质谱分析技术，比较了CD22BBz CAR T细胞在与野生型（WT）和CD22-low白血病细胞共培养时的磷酸化蛋白变化。结果显示，低抗原刺激显著降低了CAR T细胞中与细胞骨架重排和MAPK信号通路相关的磷酸化事件，表明低抗原密度对CAR T细胞的远端信号传导有显著抑制作用。进一步实验结果显示，低抗原刺激导致LAT（T细胞存活和激活所必需的支架蛋白）的多个关键激活位点（如Y132、Y171、Y191和Y226）的磷酸化水平显著降低，进而影响了下游信号分子PLCγ和ERK的磷酸化。这些结果表明，低抗原刺激不仅抑制了LAT的激活效率，还损害了其下游信号传导，这可能是CAR T细胞对低抗原表达白血病细胞反应不佳的根本原因。

为了克服低抗原刺激下低效率的LAT磷酸化，本文研究人员将第二代CAR（CD22BBz）与一个包含LAT细胞内结构域的辅助性CAR（LAT-CAR）共同表达，构建了一种双顺反子CAR平台，即辅助性LAT激活CAR T细胞（ALA-CART）平台。通过体外实验和体内动物模型，研究结果证实ALA-CART平台能够显著恢复LAT的激活，增强ERK/MAPK信号通路的活性，并提高细胞毒性功能。ALA-CART细胞对CD22-low和WT白血病细胞均表现出更强的杀伤能力，并且在NSG（NOD-scid IL2Rγnull）小鼠模型中能够完全清除CD22-low白血病细胞，并显著延长小鼠的生存期。此外，为了专门解决CD22低逃逸问题，研究人员单一靶向CD22的ALA-CART平台（22ALA-CART）。实验结果表明，22ALA-CART在体外对CD22低表达白血病细胞展现出显著的杀伤效果，并且在体内实验中能够完全清除CD22低表达的白血病细胞，显著延长小鼠的生存期。同样的，靶向CD19的ALA-CART细胞也能显著减少CD19低表达的白血病负荷，延长生存期。由此证明ALA-CART平台可以增强CAR T细胞对单一抗原的敏感性。值得一提的是，尽管ALA-CART细胞在清除白血病细胞方面表现出更高的效率，但在小鼠模型中并未观察到其导致更高的体重下降或细胞因子水平异常升高，这表明ALA-CART细胞的增强疗效并未伴随更高的毒性风险。

随后，研究人员探索了ALA-CART增强T细胞在体内的扩增和抗低抗原白血病的功效的原因。研究结果发现，第二代CAR和LAT-CAR在ALA-CART细胞中可以独立发挥作用，并且它们的功能具有累加效应。ALA-CART结构中的任何一个CAR组件都可以驱动对白血病的有效反应，揭示了该平台在“OR-gated” CAR策略（一种创新的CAR T细胞设计思路，通过允许CAR T细胞识别多种抗原来增强其抗肿瘤能力）中的潜力。与此同时，研究人员发现LAT-CAR的存在对于ALA-CART细胞在低抗原刺激下的增殖至关重要，而第二代CAR则负责提供有效的细胞毒性功能。在体内实验中，仅表达LAT-CAR的CAR T细胞能够显著增强对低抗原表达白血病细胞的清除效果，但缺乏第二代CAR时，其细胞毒性功能会受到限制。相反，仅表达第二代CAR的CAR T细胞虽然具有较强的细胞毒性功能，但在低抗原刺激下的增殖能力不足。这些结果表明，ALA-CART细胞的增殖能力主要依赖于LAT-CAR，而其细胞毒性功能则主要依赖于第二代CAR。ALA-CART平台通过整合LAT-CAR和第二代CAR的独立功能，实现了对低抗原表达白血病细胞的高效清除，同时保持了较强的增殖能力。

进一步地通过转录组分析、表型分析以及功能评估，研究人员发现ALA-CART平台能够抑制T细胞分化，使其保持更多干细胞样记忆T细胞（TSCM）的特性，表现为更高的TSCM比例和更低的效应记忆T细胞（TEM）比例。这些数据表明，ALA-CART细胞对低抗原表达白血病的有效性源于在体内遇到白血病时LAT驱动的T细胞分化减少和LAT的主动激活。为了探究ALA-CART信号的最近端下游效应，研究人员检测了刺激后30分钟的转录变化。结果显示，激活的ALA-CART细胞表现出显著的转录变化，特别是MAPK信号通路和AP-1、NFAT转录因子活性的增强。这些变化有助于T细胞存活和记忆细胞形成，从而提高CAR T细胞在体内的持久性。此外，ALA-CART细胞还表现出较低的TOX和CD39表达，这些标志物通常与T细胞耗竭相关。这些结果表明ALA-CART信号显著改变了T细胞的早期转录景观，不仅影响了它们的即时功能，而且改变了它们的分化和持久性的潜力。与此同时，基于NSG小鼠模型的实验结果证实，ALA-CART细胞在体内也表现出显著增强的持久性。与传统CAR T细胞相比，ALA-CART细胞在骨髓中的数量更高，并且维持时间更长。此外，ALA-CART细胞中TCM亚群的比例显著增加，而TEM亚群的比例较低，表明ALA-CART平台通过增强T细胞的干细胞特性，显著提高了CAR T细胞在体内的持久性，为长期抗肿瘤效果提供了支持。

综上所述，本研究合理设计的用于恢复LAT活性的ALA-CART平台，提高了MAPK信号传导和AP-1活性，并推动了对低抗原白血病的体内反应增强和持久性的延长。因此，ALA-CART平台克服了CAR T细胞疗法中低抗原表达白血病细胞逃逸和CAR T细胞持久性不足的问题。这一创新平台不仅提高了CAR T细胞对低抗原表达细胞的敏感性，还增强了其在体内的持久性，为CAR T细胞疗法的长期疗效提供了新的策略。此外，该研究还揭示了LAT在CAR T细胞信号传导中的重要作用，为未来CAR T细胞疗法的优化提供了理论基础。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ccell.2025.02.008

制版人： 十一

参考文献

1. Maude, S.L., Frey, N., Shaw, P.A., et al. (2014). Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.N. Engl. J. Med.371, 1507–1517.

2. Gardner, R., Wu, D., Cherian, S., et al. (2016). Acquisition of a CD19-negative myeloid phenotype allows immune escape of MLL-rearranged B-ALL from CD19 CAR-T-cell therapy.Blood127, 2406–2410.

3. Fry, T.J., Shah, N.N., Orentas, R.J., et al. (2018). CD22-targeted CAR T cells induce remission in B-ALL that is naive or resistant to CD19-targeted CAR immunotherapy.Nat. Med.24, 20–28.

4. Majzner, R.G., Rietberg, S.P., Sotillo, E., et al. (2020). Tuning the Antigen Density Requirement for CAR T-cell Activity.Cancer Discov.10, 702–723.

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