Nat Commun | 刘伟/刘忠民/李健潮首次揭示PPEF磷酸酶受双重钙离子传感器协同驱动的激活机制

近日，北京大学医学部刘伟研究员团队，以深圳北京大学香港科技大学医学中心为第一完成单位，联合南方科技大学刘忠民教授团队及华南理工大学李健潮教授团队，在

Nature Communications

Structural insights into the dual Ca

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-sensor-mediated activation of the PPEF phosphatase family

作为细胞信号转导的关键调控因子，PPEF家族磷酸酶与乳腺癌、胃癌及遗传性视网膜退行性疾病密切相关。在哺乳动物中，PPEF1在感觉神经元、生殖系统及免疫器官中广泛分布，不仅是乳腺癌发生发展的关键生物标志物，还可作为胃癌mRNA疫苗的潜在靶点；PPEF2则通过调控凋亡信号激酶参与癌症进程，其错义突变与先天性遗传疾病密切相关。然而，与其他磷酸酶家族成员相比，PPEF亚型的结构基础与分子机制长期未明，极大制约了其生物学功能解析及疾病干预策略的开发。

本研究以PPEF家族的原型成员——果蝇视网膜退化蛋白RDGC为切入点，结合冷冻电镜（Cryo-EM）、X射线晶体学和分子生物学等多学科技术，系统解析了RDGC/钙调蛋白（CaM）全酶复合物在无钙（自抑制态，3.6 Å）和钙结合（激活态，2.8 Å）条件下的高分辨率冷冻电镜结构。

通过冷冻电镜图像和X射线晶体学数据，本研究清晰描绘了PPEF磷酸酶从静息状态到催化位点暴露的动态构象转变过程，揭示了PPEF家族双重钙传感器（CaM和EF-like/EF-hand结构域）协同驱动的“杠杆式”激活机制：在静息状态下，CaM与EF-like/EF-hand结构域协同作用，通过延伸IQ基序（extended-IQ motif）形成“分子锁”，封闭催化位点；钙离子结合后，双重钙传感模块触发延伸 IQ基序发生构象翻转，催化中心暴露，从而实现激活。进一步研究发现，PPEF蛋白磷酸酶受双重钙离子传感器激活的分子机制在进化过程中高度保守，这为在原子层面解析PPEF家族诱发癌症、遗传性疾病的分子病理提供了关键结构框架。

本研究的关键发现包括：

1.RDGC/CaM全酶复合物自抑制态结构解析：在无钙条件下，研究团队利用6,822张冷冻电镜图像重构出分辨率为3.6 Å的RDGC/CaM复合物结构。结果显示，RDGC的延伸IQ基序（aa 1–61）通过N端的经典IQ基序（aa 1–25）与CaM结合，而C端α螺旋（aa 26–61）与EF-like/EF-hand结构域形成疏水互作，共同封闭催化位点（Asp158、His160等）（图1）。

进一步分析表明，关键抑制界面包括CaM结合界面和EF-like/EF-hand结合界面。CaM结合界面上，延伸IQ基序中的Ile12、Trp15、Tyr16嵌入CaM C叶的疏水口袋（Ile86、Phe90等），通过氢键（Lys14-Glu48等）稳定结构。EF-like/EF-hand结合界面上，EF-like结构域的Leu446、Leu476等与延伸IQ基序的Ile33、Leu37等形成疏水互作，EF-hand结构域的Leu557、Leu558等与延伸IQ基序的Phe51、Phe52等紧密堆积。此外，延伸IQ基序的Tyr39通过阳离子-π作用与催化位点Arg333结合，有效阻断底物进入。

2. RDGC/CaM全酶复合物激活态结构解析：在10 mM CaCl2条件下，研究团队利用815,266个冷冻电镜颗粒重建出2.8 Å分辨率的RDGC/CaM激活态结构。结果显示，钙离子结合触发双重钙传感器的重构，导致CaM和EF-like/EF-hand结构域发生协同构象变化。具体而言，CaM结合钙离子后，CaM的N叶与C叶间距缩短，形成更紧凑的构象，并将延伸IQ基序N端（Ile6、Ile10）拉入疏水口袋。同时，EF-hand结构域的Asp539、Glu550等残基结合钙离子后，推动延伸IQ基序翻转，从而暴露催化位点，最终形成由两个RDGC和两个CaM组成的异源四聚体（70 Å × 186 Å），显著增强磷酸酶催化活性。

3. 关键位点突变实验验证。为进一步验证磷酸酶功能的关键调控位点，研究团队开展了一系列突变实验。CaM结合缺陷突变：将延伸IQ基序中的Ile12突变为谷氨酸，导致CaM结合亲和力下降236倍，并显著降低磷酸酶活性。EF-hand钙传感失效：将EF-hand结构域的钙结合位点Asp539-Asp541-Glu545-Glu550-Asn581-Asp583-Lys585突变为丙氨酸，完全破坏钙离子结合，使磷酸酶活性在钙离子存在时无显著提升。延伸IQ基序的杠杆效应阻断：将延伸IQ基序的Cys29-Asn30-Trp31-Gln32突变为甘氨酸，阻断钙诱导的构象传递，导致磷酸酶活性降低。

4. PPEF家族的功能保守性。进一步的结构预测和实验验证表明，PPEF家族的双重钙离子传感激活机制在哺乳动物中具有高度保守性。结构预测：哺乳动物PPEF1/2与RDGC在延伸IQ基序和EF-like/EF-hand结构域的一级序列高度保守，AlphaFold预测的PPEF1/2模型与实验解析结构高度相似。功能保守性实验：在小鼠PPEF1中同样观察到钙离子依赖的酶活增强现象，而CaM结合缺陷（Ile17-Leu21-Val22-Ile23-Trp26-Tyr27突变为谷氨酸）和EF-hand钙结合缺陷（Asp580-Asp582-Leu586-Glu591-Asn622-Asp624-Asn626突变为丙氨酸）均导致磷酸酶活性下降。

图1 PPEF家族蛋白磷酸酶调控机制示意图

本研究的创新之处在于，首次揭示了PPEF家族磷酸酶通过双重钙传感器协同作用驱动延伸IQ基序“杠杆式”翻转的激活机制，为理解丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶的动态调控提供了新视角（图1）。同时，通过结构-功能解析锁定关键调控位点，为靶向PPEF介导的疾病（如乳腺癌、胃癌及遗传性神经退行性疾病）提供了潜在的精准干预策略。此外，该研究还为其他钙依赖性磷酸酶的调控机制提供了借鉴，为新型药物开发和信号通路研究奠定了基础。

该论文由刘伟研究员、刘忠民教授和李健潮教授共同担任通讯作者。医学中心博士研究生刘佳与南方科技大学博士研究生吴藏为共同第一作者。医学中心技术员刘宇扬、陈倩苟，硕士研究生丁玉珍，以及上海有机所潘李锋教授、林芷乔和医学中心肖康博士均为本研究做出了重要贡献。

https://www.nature.com/articles/s41467-025-58261-z

制版人： 十一

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