天津大学NC：挖掘高效电子传递载体助力电能细胞工厂“火力全开”

1937 年诺贝尔奖生理学家 Albert Szent-Gyorgyi 曾说：“Life is nothing but an electron looking for a place to rest（生命只不过是电子寻找休憩之地的过程）”。所有的生命细胞都依赖氧化还原反应来产生能量，即电子从供体释放（氧化），经过电子传递链被受体（还原），这一些列电子传递过程最终产生细胞通用能量货币 ATP。人类等哺乳动物细胞依赖胞内电子传递过程进行“胞内有氧呼吸”，同样电能微生物细胞依赖胞外电子传递过程进行“胞外电极呼吸”。

电能细胞是一类能够与外界环境进行双向电子交换的微生物，基于电能细胞双向电子传递和能量交换机理构建的微生物电催化系统，为满足环境生态修复、“双碳”减排、绿色生物制造等国家能源和环境领域的重大需求，提供了极具发展潜力的解决方案。然而，电子在传递过程中往往存在胞内通量小、跨膜速率慢、界面定向差等关键问题，导致了电能细胞的物质-能量转化效率差、电子传递效率低，影响了微生物电催化系统的催化效率。

针对上述关键问题，天津大学合成生物技术全国重点实验室李锋/宋浩团队在先前的工作中分别针对电能细胞底物谱范围窄、电子池容量小导致胞内电子通量小的问题，创新性提出了底物谱工程和电子池工程调控策略，扩大了胞内电子通量。同时，针对电能细胞在电极表面形成生物膜能力弱导致胞外电子传递定向差的问题，开发了基于生物膜生命周期工程和细胞形态工程调控技术，增强生物膜形成过程中细胞-电极间、细胞-细胞间界面作用，实现了电子到电极的靶向传递。

然而，细胞膜的绝缘双层磷脂分子层仍严重阻碍电能细胞的电子双向跨膜传递。虽然该研究团队先前已经通过挖掘筛选不同导电色素蛋白和导电蛋白簇，构建了电子传递效率高的人工导电色素蛋白通道和蛋白纳米线，提高了电能细胞跨膜电子流速。然而，电子载体介导胞外电子传递的机制不清晰、电子传递载体浓度低、合成-传递不平衡，导致电子跨膜传递阻力大，限制了电子跨膜传递速率。

近日，李锋/宋浩团队在 Nature Communications 发表了题为“Dynamic synthesis and transport of phenazine-1-carboxylic acid to boost extracellular electron transfer rate”的研究论文，通过阐明电子传递载体基于浓度依赖型的电子传递机制，开发了响应胞内电子传递载体浓度的传感器，解耦了电子传递载体的高效定量合成和实时跨膜传递过程，突破了电子传递载体的合成和耐受浓度极限，显著降低了电子跨膜传递的阻力，获得了电子传递载体介导的世界报道电子传递速率最高值。天津大学化工学院李锋副研究员和东北大学生科院张保财副教授为论文共同第一作者，宋浩教授为论文通讯作者。

挖掘、筛选和构建高效电子传递载体吩嗪-1-羧酸（PCA）合成路径。

为筛选高效电子传递载体，本研究从吩嗪类化合物（PCA、PCN、PYO）、黄素类化合物（RF、FMN、FAD）以及蒽醌类化合物（AQDS、AQS、2-HNQ）中分别选取三种典型化合物并设置浓度梯度用于测试其电子传递速率，发现外源添加 PCA 浓度在 80 µM 时，介导的电能细胞产电最大功率密度达 3382.13 ± 37.54 mW m-2 。为进一步在电能细胞中构建 PCA 生物合成途径，从 9 株 PCA 天然合成菌株中挖掘到 11 条 PCA 生物合成基因簇，通过异源表达，构建得到 PCA 合成重组菌株 SC7，PCA 合成浓度达到 8.72 ± 0.76 µM，最大输出功率密度达到 1185.93 ± 63.46 mW m-2，相比于野生电能细胞（84.30 ± 2.53 mW m）提高 14.07 倍。为了使合成的 PCA 达到最优介导浓度，进一步通过启动子工程，筛选高强度启动子 Ptac 提高 PCA 合成基因簇表达强度，合成的 PCA 浓度达到 72.74 ± 4.30 µM，最大输出功率密度达到 1757.87 ± 28.91 mW m-2。

工程电能细胞细胞膜通透性强化电子传递载体 PCA 传递。

为加速 PCA 跨膜传递，进一步挖掘筛选内膜外排泵与外膜孔蛋白，增强细胞膜通透性。作者挖掘到 6 个外膜孔蛋白与 4 个内膜外排泵。利用希瓦氏菌 pYYDT&pHG13 双质粒表达系统，高效组装 PCA 合成模块与 PCA 传递模块，构建得到 10 种重组菌株 SP1-SP10。其中 SP1 菌株（Ptac-phzABCDEFG 和 PlacUV5-oprF）通过过表达外膜孔蛋白 OprF 有效提高了胞外电子传递速率，最大输出功率密度达到 2262.45 ± 10.92 mW m，较其母系菌株 SO3 提高 1.29 倍。然而与 SO3 菌株相比，SP1 细胞呈现较高比例的死细胞。并且 SP1 菌株在 15 h 左右细胞生长达到平台期，最大细胞密度（OD600）达到 0.91，相比之下，SO3 菌株在 12.5 h 左右生长达到平台期，最大 OD600 稳定在 1.03。这些结果表明过表达外膜孔蛋白 OprF，重组菌株 SP1 细胞代谢受到影响，导致细胞生长缓慢，死细胞比例提高，抑制 PCA 合成。作者推测，这可能是由于细胞生长前期同时进行 PCA 合成与孔蛋白表达两个过程，孔蛋白 OprF 作为膜蛋白，其过早表达可能会引发重组菌株代谢负荷，产生细胞毒性，因此抑制电能细胞生长。

动态解耦 PCA 生物合成和转运成功缓解孔蛋白的细胞毒性。

为了解决孔蛋白 OprF 引发的细胞毒性，本研究提出动态调控工程策略对 PCA 合成与传递进行解耦。即在 PCA 初始合成阶段，胞内 PCA 浓度较低，细胞仅合成 PCA 而不表达孔蛋白 OprF。当胞内合成的 PCA 积累到一定浓度时，利用 PCA 生物传感器感应胞内 PCA 浓度，调控开启孔蛋白 OprF 表达，加速 PCA 传递。本研究挖掘筛选到响应氧化还原压力传感器 PsoxR-soxR-PsoxS，该传感器由组成型启动子 PsoxR、效应蛋白 SoxR以及诱导型启动子 PsoxS 三部分组成，组成型启动子 PsoxR 驱动效应蛋白 SoxR 表达，含有[Fe-S]的效应蛋白 SoxR 形成二聚体，与诱导型启动子 PsoxS 结合。效应蛋白 SoxR 二聚体中的[2Fe-2S]可被 PCA 氧化，导致二聚体蛋白构象转变，进而活化诱导型启动子 PsoxS 驱动下游基因表达，使其作为 PCA 生物传感器感应胞内 PCA 浓度。随后，将外膜孔蛋白 OprF 连接在 PCA 生物传感器 PsoxR-soxR-PsoxS 下游，并组装在质粒表达载体 pHG13 中，构建得到重组菌株 SD1（pYYD-Ptac-phzABCDEFG 和 pHG13-PsoxR-soxR-PsoxS-oprF）得到重组菌株 SD1。进一步通过定点突变优化传感器核心序列（突变体 SDV3），使 OprF 表达时机与 PCA 积累同步，有效解决了 PCA 代谢带来的细胞毒性问题。其中 SDV3 输出最大功率密度最高，较 SP1（2262.54 ± 10.92 mW m-2）提高了 1.26 倍。以上结果证明，动态解耦 PCA 生物合成和转运缓解孔蛋白 OprF 导致的细胞毒性，能够有效提高重组菌株的胞外电子传递速率。

阐明 PCA 介导的电能细胞电生理调控机制。

为阐明 PCA 增强电能细胞胞外电子传递机制，作者结合体外氧化动力学、差分脉冲伏安扫描、蛋白分子对接模拟、色素蛋白定点突变等对细胞电生理、细胞代谢与细胞行为进行了研究。首先通过分别和联合敲除外膜色素蛋白 MtrC 或 OmcA 证明了 PCA 依赖外膜细胞色素 MtrC 和 OmcA 捕获电子。停留光谱实验测定其体外氧化动力学反应，证实 PCA 通过 MtrC 或 OmcA 传递电子。进一步利用差分脉冲伏安扫描揭示 PCA 分子胞外电子传递为浓度依赖型：在低浓度时，PCA 分子作为辅因子，与外膜色素蛋白OmcA、MtrC 结合形成复合体介导胞外电子传递；在高浓度时，由于结合位点饱和，冗余的 PCA 分子通过分子扩散介导电子传递。差分脉冲伏安结果显示，自由态 PCA 特征峰为-0.366 V，低浓度 PCA 在菌体中峰位移至-0.218 V（辅因子结合态），随浓度升高逐渐恢复至自由态峰位。而在色素蛋白缺失突变菌株 WTΔmtrC 与 WTΔomcA 中，细胞膜外色素蛋白的缺失导致 PCA 结合位点变少，随着 PCA 浓度提高，色素蛋白缺失突变菌株中 PCA 结合位点比野生型电能细胞更快的达到饱和，剩余的 PCA 分子以自由态通过分子扩散介导胞外电子传递。为进一步探明 PCA 分子与外膜色素蛋白 MtrC、OmcA 相互作用位点，通过分子对接模拟，分析、预测了潜在作用位点，进一步通过氨基酸定点突变验证了这些潜在的作用位点。

解析 PCA 介导的电能细胞细胞代谢与细胞行为调控机制。

作者进一步结合细胞转录组学分析和生化实验表征，首次证明 PCA 分子能够增强胞内信号分子 cAMP 合成、提高 cAMP 胞内浓度。胞内 cAMP 水平的提高将激活乳酸代谢、色素蛋白合成相关基因表达，减缓细胞表层黏附蛋白分解，从而加强电子供体乳酸代谢、促进细胞导电色素蛋白表达以及增强导电生物膜形成，由此提高了重组菌株 SDV3 的胞外电子传递。研究结果表明，PCA 作为电子传递载体与外膜色素蛋白 MtrC 和 OmcA 相互作用介导电子传递是 PCA 增强希瓦氏菌胞外电子传递的主要机制途径，而 PCA 增强优化希瓦氏菌细胞代谢和生物膜形成，则是增强胞外电子传递的次要机制途径。

综上，本研究通过系统地筛选比对，挖掘到来自吩嗪类高效电子传递载体 PCA，进一步通过开发和优化 PCA 生物传感器，设计构建了 PCA 合成控制开启 PCA 传递的动态调控基因线路，动态解耦了 PCA 合成与传递过程，成功在电能细胞希瓦氏菌菌中构建了 PCA 介导的高效电子传递途径，工程菌株输出功率密度达到 2.85 ± 0.10 W m-2，是当前报道的功率密度最高的重组希瓦氏菌。进一步在此基础上系统解析和阐明了 PCA 增强希瓦氏菌胞外电子传递的细胞电生理机制和细胞代谢与行为调控机制。

该工作得到了国家重点研发计划(2024YFC3407000和2018YFA0901300)、国家自然科学基金(NSFC 22378305、32071411、22478293和32001034)、天津市科技计划项目(24JCYBJC01120)和海河实验室可持续化学转化(24HHWCSS00004)项目的支持。

1. Li, F., Zhang, B., Long, X. et al. Dynamic synthesis and transport of phenazine-1-carboxylic acid to boost extracellular electron transfer rate. Nat Commun 16, 2882 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-57497-z

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