西南大学张勇课题组解析4种anti-CRISPR蛋白对多种植物CRISPR-Cas12a基因组编辑的抑制效果

CRISPR-Cas系统的出现推动了基因组编辑的革命性发展，其中II型和V型系统应用最广泛。为对抗该防御机制，噬菌体进化出Anti-CRISPR蛋白（Acr），目前已知5种V-A型AcrVA蛋白，其中AcrVA1和AcrVA5在烟草和水稻中证实能抑制LbCas12a与Mb2Cas12a核酸酶的编辑及调控活性。然而，不同AcrVA蛋白对其他Cas12a同源蛋白的抑制作用仍需深入研究。2025年3月27日，Plant Physiology杂志在线发表了西南大学张勇课题组题为Systemic evaluation of the inhibitory effects of 4 anti-CRISPR systems on different Cas12a nucleases in rice的研究论文。

该研究基于type V Acr蛋白与不同Cas12a同源蛋白，设计了type V型Acr蛋白和Cas12a核酸酶共表达策略的植物基因组编辑新系统，分析Acr蛋白对Cas12a植物基因编辑活性和特异性的影响，实现了水稻内源基因高特异性有效编辑，进一步丰富了植物基因组编辑工具库。全文主要结果简述如下：

1. 4种Anti-CRISPR-Cas12a蛋白在大肠杆菌中的编辑表征

应用质粒干扰实验在大肠杆菌中研究不同Acr蛋白对AsCas12a和FnCas12a的抑制效果（图1a）。实验结果表明，对于AsCas12a，AcrVA1显示出最明显的抑制效果，其次是AcrVA4，而AcrVA5和AcrC03在大肠杆菌中几乎没有显示出任何抑制活性（图1b）;FnCas12a被AcrVA1和AcrVA4强烈抑制，而AcrVA5和AcrC03蛋白在大肠杆菌中未能显示出抑制活性（图1c）。

图1 多种Anti-CRISPR-Cas12a系统的细菌编辑特性

2. Acr蛋白在水稻原生质体中抑制FnCas12a、AsCas12a及Mb3Cas12a介导的基因组编辑

通过设计type V型Acr蛋白和Cas12a核酸酶共表达策略的植物基因组编辑新系统，分析Acr蛋白对Cas12a植物基因编辑活性（图2a）。在水稻原生质体中，共表达AcrVA1在全部六个目标位点显著降低了AsCas12a的编辑效率，共表达AcrC03在四个目标位点显著降低了AsCas12a的编辑效率，而AcrVA4和AcrVA5蛋白在所有目标位点均未显示明显抑制效果（图2b）。作者在相同的六个位点测试了AcrVA1、AcrVA4、AcrVA5和AcrC03在水稻中对FnCas12a和Mb3Cas12a的多重编辑的抑制效果。与AsCas12a的情况不同的是，在水稻原生质体中，AcrVA1和AcrVA4在六个目标位点均显著抑制了FnCas12a的基因组编辑活性，且AcrVA4的抑制效果更强,而AcrVA5和AcrC03的抑制作用较弱（图2c）。对于Mb3Cas12a,AcrVA1在六个目标位点显著抑制了Mb3Cas12a的基因组编辑活性，AcrVA4的抑制效果较弱,而AcrVA5和AcrC03对Mb3Cas12a核酸酶的编辑活性无显著影响（图2d）。这些数据表明，AcrVA1是广谱强效抑制剂（对3种Cas12a均有效），与LbCas12a结果一致（He et al., 2024），而AcrVA4抑制效果具有变体特异性。

图2 Acr蛋白有效抑制AsCas12a、FnCas12a和Mb3Cas12a植物基因组原位编辑

3. Acr蛋白在植物中阻止FnCas12a及Mb3Cas12a介导的基因组编辑及降低脱靶效应

为验证不同AcrVA蛋白能否通过抑制Cas12a活性来降低基因组编辑的脱靶效应（图3a），作者在稳定转化的水稻株系中测试了FnCas12a和Mb3Cas12a对六个靶位点的多重编辑效果。水稻稳定转化结果分析显示，FnCas12a在六个目标位点实现了21.1%-63.2%的编辑效率。AcrVA1共表达后，在三个位点对FnCas12a编辑效率完全抑制，AcrVA4共表达后，在四个位点对FnCas12a编辑效率完全抑制，AcrVA5共表达后，有三个位点的编辑效率也有所下降，但程度较小，而当AcrC03共表达后，对FnCas12a无显著抑制作用（图3b）。Mb3Cas12a在六个目标位点实现了40.0%-80.0%的编辑效率。AcrVA1共表达后，在五个位点对Mb3Cas12a编辑效率完全抑制，AcrVA4、AcrVA5及AcrC03共表达后，有五个位点的编辑效率也有所下降，但程度较小（图3c）。通过Cas-OFFinder预测crRNA脱靶位点，检测结果数据分析显示，在对照组植株中的脱靶位点检测到突变，而在AcrVA1/AcrVA4/AcrVA5共表达植株中均未检测到脱靶编辑，说明Acr蛋白的表达能显著降低FnCas12a和Mb3Cas12a在水稻中的脱靶效应（图3d和3e）。

图3 Acr蛋白在水稻植株中降低靶向位点编辑效率及crRNA依赖性脱靶效应

西南大学与西部（重庆）科学城种质创制大科学中心联合培养博士后何瑶博士、四川省食用菌研究所刘诗诗博士为论文共同第一作者，西南大学生命科学学院张勇教授、马里兰大学Yiping Qi教授为论文共同通讯作者。研究工作得到了国家科技创新2030－“农业生物育种”重大专项、国家自然科学基金等项目资助。

论文链接：

https://academic.oup.com/plphys/article/197/3/kiaf097/8097899?utm_source=advanceaccess&utm_campaign=plphys&utm_medium=email