切向流过滤 | CAR-T治疗的基石：慢病毒载体下游纯化工艺的突破

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在肿瘤治疗领域取得了突破性进展，而慢病毒载体（Lentiviral Vector, LV）作为基因递送系统的核心原材料，其下游纯化工艺的优化直接关系到治疗的安全性和经济性。本文系统综述了LV下游纯化工艺的三大阶段——澄清过滤、纯化与精纯灭菌的技术进展，重点探讨切向流过滤（TFF）的应用策略，分析膜材料选择、工艺参数控制对LV活性与回收率的影响，并提出规模化生产中面临的挑战与未来研究方向。

CAR-T疗法与慢病毒载体的重要性

CAR-T疗法通过基因工程改造患者T细胞实现精准抗肿瘤效应，其临床疗效已在血液系统恶性肿瘤中取得显著突破。然而，CAR-T细胞生产工艺复杂，其中慢病毒载体介导的基因转导环节成本占比高达30%-50%，且LV的活性与纯度直接影响CAR-T细胞的功能与安全性。因此，构建高效、稳定且符合GMP要求的LV下游纯化工艺，成为推动CAR-T疗法产业化的核心课题。

慢病毒载体下游纯化的三大步骤

慢病毒的活性受到工艺过程中温度、pH、盐浓度、渗透压以及剪切力的影响，因此在下游纯化过程中需要格外关注这些条件对慢病毒载体活性的影响。

1、澄清过滤

澄清过滤旨在去除细胞培养液中的细胞碎片及大颗粒杂质（>1 μm）。当前主流的工艺结合低速离心（<5000×g）与深层过滤技术，通过错流设计可有效降低滤器堵塞风险，尤其适用于中试及以上规模的连续处理。例如，采用孔径为0.45-1.2 μm的聚醚砜（PES）深层滤膜，可高效截留颗粒污染物并减少80%以上的宿主细胞蛋白（HCP）负载量，为后续纯化阶段奠定高质量基础。

2、纯化

适用于LV中度纯化的策略主要包括层析和切向流过滤。切向流过滤（TFF）中的超滤渗滤（UFDF）是慢病毒载体（LV）大规模纯化和浓缩以及缓冲液置换的关键步骤。

在UFDF过程中，病毒颗粒被浓缩的同时，分子量小于膜孔径的杂质（如DNA）会随透过液被有效去除。从工艺流程的角度来看，TFF既可以在澄清后阶段应用，通过浓缩减少后续层析步骤的料液体积，也可以在中度纯化和精纯之间使用，通过缓冲液置换调节样品的pH和电导率，从而为后续层析操作创造有利条件。

由于LV容易失活，工艺过程中需要严格控制剪切力、通量、跨膜压和操作时间等参数，并选择合适的膜材料和孔径，以确保LV的活性。适用于LV纯化的膜材料包括聚醚砜（PES）和再生纤维素（RC）。此外，膜孔径的选择也至关重要：孔径越大，杂质清除率越高，但可能导致LV回收率下降。因此，需要根据具体工艺条件选择最合适的膜材料和孔径。

3、精纯及灭菌

适用于LV精纯的策略主要有SEC（尺寸排阻色谱）以及TFF（切向流过滤）。通过TFF进一步浓缩，供需要更高浓度病毒的群体使用。不过高剪切力（>5000 s⁻¹）与跨膜压（TMP>1.5 bar）易导致LV衣壳破裂，需通过动态压力控制将通量维持在20-40 LMH以维持活性。最后进行无菌过滤，通常选用0.22μm的滤膜进行过滤进行灌装。

▲Oxford BioMedica为诺华Kymriah代工的慢病毒制造流程（图片来源：Molecular Therapy）

当前挑战和未来方向

尽管LV纯化技术已取得显著进展，仍存在以下瓶颈：

（1）膜污染导致的批次间一致性差异；

（2）超离心与层析设备的高资本投入；

（3）LV体外稳定性不足导致的冷链运输成本攀升。

为进一步提升LV生产的可及性与经济性，未来研究可聚焦于：

(1)新型仿生膜材料（如石墨烯氧化物复合膜）的开发

(2)连续流纯化工艺的整合

(3)冻干制剂技术的突破

慢病毒载体（LV）下游纯化是CAR-T疗法产业化的核心环节，而切向流过滤（TFF）的应用显著提升了LV的纯度和回收率。然而，膜污染、工艺稳定性及冷链依赖仍是主要挑战。未来，通过新材料开发、连续流工艺优化和冻干技术创新，有望进一步突破技术瓶颈，推动CAR-T疗法从实验室走向更广泛的临床应用。