Nature | 肌营养不良症中的转录适应性机制：基因突变如何驱动UTRN上调

撰文 | 阿童木

杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy,DMD） 是一种X染色体连锁隐性遗传病，主要表现为进行性骨骼肌退行性病变。DMD的发病机制源于编码抗肌萎缩蛋白 （dystrophin） 的DMD基因突变，该基因位于染色体Xp21.2上，包含79个外显子和78个内含子。当DMD发生突变时，抗肌萎缩蛋白的产生受阻，导致肌肉细胞膜脆弱易损，最终引发肌肉萎缩和功能丧失【1】。

研究表明，在DMD患者和mdx小鼠模型中，肌营养蛋白（utrophin，UTRN） 的表达在骨骼肌肌膜中显著上调。UTRN是抗肌萎缩蛋白的同源物，由UTRN编码。UTRN的表达上调被视为机体对抗肌萎缩蛋白缺失的一种补偿机制【2】。有趣的是，UTRN的上调与DMD的突变类型密切相关。研究发现，携带导致提前终止密码子 （PTC） 的移码或无义突变的患者及mdx小鼠，其骨骼肌膜中UTRN会明显上调，而框内缺失的患者则未表现出这种现象【3】。

临床研究显示，UTRN表达水平与DMD病程严重程度呈负相关，即UTRN表达越高，病程越轻，因而上调UTRN被认为是一种部分抵消抗肌萎缩蛋白缺失的潜在治疗策略【4】。目前的主流观点是，UTRN上调是由于抗肌萎缩蛋白的缺失所致，但具体的信号通路和调控机制仍有待深入研究。

近日，马克斯-普朗克心脏和肺部研究所Didier Y. R. Stainier实验室等在Nature杂志发表了题为Transcriptional adaptation upregulates utrophin in Duchenne muscular dystrophy的研究文章，揭示了DMD突变mRNA的降解通过转录适应性（transcriptional adaptation,TA）机制驱动了UTRN的上调，从而补偿了缺陷基因的功能。此外，剪接转换反义寡核苷酸（splice-switching ASO）和自切割核酶可通过诱导TA实现基因补偿，为DMD治疗提供了新策略。

DMD外显子37 （E37） 突变与部分DMD患者较轻的临床症状相关，且生物信息学分析预测E37容易发生外显子跳跃【4】。研究首先以DMD外显子37 （E37） 的剪接调控为切入点，探讨了DMD移码和无义突变对UTRN表达的影响。结果表明，通过喜树碱 （CPT） 处理抑制转录延伸会导致E37跳跃，而通过曲古抑菌素A （TSA） 处理增强转录延伸则促进E37保留 （inclusion） ，即转录速率会显著影响E37的剪接模式。

通过CRISPR-Cas9技术构建的DMD^PTC/+细胞中，PTC突变能够显著促进E37的跳跃，并避免NMD（nonsense-mediated mRNA decay）对DMD的降解。进一步分析表明，缺失的20个碱基区域包含多个剪接增强子，这些增强子的缺失导致了E37跳跃的增强。DMD^PTC/+细胞所携带的PTC突变导致DMD的mRNA水平下降，并诱导了UTRN mRNA和蛋白表达显著上调。因此，DMD突变mRNA降解通过RNA介导的反馈调节机制激活了UTRN的表达。

TSA处理可诱导DMD mRNA降解并促进UTRN上调，其作用呈时间和剂量依赖性。去除TSA后，DMD E37的剪接以及DMD和UTRN的mRNA水平都可以恢复。阻断NMD可以使DMD突变mRNA水平上升，并抑制UTRN上调，这进一步证实了DMD突变mRNA的降解在UTRN表达调控中起着关键作用。

此外，通过DMD过表达实验，作者发现DMD^PTC/+细胞中UTRN的上调是由DMD突变mRNA的降解引发的转录适应（TA）机制，而非dystrophin蛋白缺失引起。RNA-seq分析进一步揭示，DMD患者iPS细胞分化的肌管中，修复DMD突变可逆转UTRN上调，验证了TA的存在。不仅如此，作者还发现多种与肌肉功能、膜修复和代谢调控相关的基因 （如ANO5、ACTA1、SERAC1、LIN28B和PPP1R14C） 在DMD突变背景下通过TA机制上调，提示这些基因可能在dystrophin缺失时发挥代偿作用。

接下来，作者通过构建含不同外显子及内含子的DMD微基因 (minigene) ，并在其中引入无义突变，进一步证实了DMD突变mRNA的降解可诱导UTRN上调。这一过程在多种细胞系中得到了验证，且UTRN上调的程度也依赖于PTC的具体位置。此外，通过引入自切割核酶实现DMD RNA的降解，同样证明了在不影响dystrophin蛋白水平的情况下，DMD mRNA的降解依然能够触发UTRN的上调。因此，DMD微基因模型及核酶介导的降解实验共同证实了TA机制在DMD病理和UTRN调控中的核心作用。

在临床背景下，作者检测了4名DMD患者肌管细胞中DMD和UTRN基因的mRNA水平，发现患者DMD mRNA水平降低和UTRN mRNA水平上升，并确认了UTRN的上调源于转录水平的增强，这进一步证明了DMD突变体mRNA降解引发UTRN转录上调的机制在DMD患者中同样存在。

接下来，作者通过设计了一种类似于Eteplirsen的剪接转换反义寡核苷酸 （splice-switching ASO） ，以促进DMDΔE52肌管细胞中DMD外显子51的跳跃。作者发现这种ASO不仅提高了DMD突变型肌管细胞中的DMD mRNA水平，还降低了UTRN的上调程度。随后，作者通过自切割核酶技术进一步提高了DMDΔE52及其他DMD患者肌管细胞中的UTRN mRNA水平。作者进一步通过外显子跳跃的策略在WT肌管细胞中诱导DMD基因的移码突变，成功触发了DMD突变mRNA的降解及UTRN的上调，证明了转录适应性 （TA） 是导致UTRN上调的主要机制。此外，作者还在C2C12小鼠骨骼肌细胞中证实了类似的结果，表明转录适应性机制在人类和小鼠中的DMD突变中均能引发UTRN的上调。

综上所述，本研究揭示了转录适应性（TA）在DMD患者UTRN上调中的关键作用，并通过开发DMD mRNA降解系统，发现PTC诱导的DMD mRNA降解触发了UTRN上调。此外，反义寡核苷酸（ASO）和自切割核酶技术的应用展示了诱导基因补偿的潜力，为未来DMD的治疗提供了新的思路。

https://www.nature.com/articles/s41586-024-08539-x

制版人：十一

参考文献

1. Duan, D., Goemans, N., et al. Duchenne muscular dystrophy.Nat. Rev. Dis. Primers.7, 13 (2021).

2. Guiraud, S. & Davies, K. Utrophin correlates with disease severity in Duchenne muscular dystrophy.Med.4, 220–222 (2023).

3. Georgieva, A. M. et al. Inactivation of Sirt6 ameliorates muscular dystrophy in mdx mice by releasing suppression of utrophin expression.Nat. Commun.13, 4184 (2022).

4. Kleopa, K. A., et al. Naturally occurring utrophin correlates with disease severity in Duchenne muscular dystrophy.Hum. Mol. Genet.15, 1623–1628 (2006).

5. Tuffery-Giraud, S. et al. Genotype-phenotype analysis in 2,405 patients with a dystrophinopathy using the UMD-DMD database: a model of nationwide knowledgebase.Hum. Mutat.30, 934–945 (2009).

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