问：中药复方做体外细胞实验怎么做？冻干粉 or 含药血清~

中药及复方的药理研究为中医中药的科学性提供证据，体外细胞培养技术在中药及复方的体外细胞实验中应用广泛，中药的复杂性使药物的添加方式成为研究的关键影响因素之一。

在此小编统计了一些关于中药体外细胞实验常见的问题及解决方案，供大家参考。

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中药体外细胞实验干预方法有哪些？

目前应用的干预方法主要有2种：中药提取物/纯化物直接添加、中药血清药理学。2种添加方法各有利弊，是否选择了合适的干预方法直接影响实验结果的可信度。

1）中药提取物/纯化物（冻干粉）直接添加

对用于细胞培养的中药及复方提取物/纯化物有较高的要求。有些研究人员使用蒸馏水煎煮回流后，直接采用水煎液进行实验。或通过水提醇沉的方法对提取液过滤、浓缩制成中药原液，然后进行实验。

随着现代药剂提取技术的进一步发展及超细粉末等新技术的应用，对粗提取物进行纯化（包括杂质的去除、酸碱度与渗透压的调整等，使提取物的质量进一步提高，理化干扰因素进一步减少），并进一步制成颗粒、粉剂或冻干粉，以便于保存，临近实验时再溶解、离心、过滤；添加至细胞培养基中使用或是用以上方法干燥成粉用适宜溶媒制成供体外细胞培养用的中药原液。此外，在正式实验前还需用微孔滤膜或高温除菌。

2）中药血清药理学

中药血清药理学是将中药或中药复方经口给动物灌服一定时间后采集动物血液，分离血清，用含有药物成分的血清进行体外实验的一种半体内实验方法。

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两种干预方法的优缺点是什么？

1）中药提取物/纯化物（冻干粉）

中药提取物/纯化物直接添加用于体外细胞培养由来已久，目前仍占主导地位，主要应用于单一中药或中药成分的细胞实验研究，或者非口服药不能运用血清/血浆药理学方法的药效研究中。

该方法具有以下优势：①传统的水提法操作时间短，可重复性好，易检测。②较血清/血浆的含药浓度，提取物的药物浓度更容易控制，随着中药提取、分离、纯化高新技术的发展应用，中药提取物的质量提高，杂质等不良因素影响减少。③对于非口服给药方式中药及复方的研究（如直肠给药、阴道给药、宫腔灌药、鼻腔吸入、皮肤局部用药等），药物不是首先进入消化道，亦不经过肝脏的首关消除，局部药效的发挥也不经过血液的稀释及循环中复杂的药代动力学变化，此类体外细胞实验研究就不适用于血清/血浆药理学，反而用传统的中药提取物添加，更能模拟真实的药物作用情况。

中药特别是复方的粗提物进行体外实验，常受到多种因素的影响：①粗提物既含有有效成分，也含有大量无效成分，能非特异性地影响和干扰体外实验结果，导致实验结果的假阳性；②传统的口服给药，中药复方进入人体后经过消化道消化吸收、肝肠循环等，可代谢产生新的物质，提取物的体外药理实验结果难以反映机体真实血药浓度下的药理作用及变化规律。

2）血清药理学

血清药理学在传统中药汤剂的药效研究中应用广泛，不仅涉及到生物体各个系统疾病的细胞实验研究中，也可涉及到中药的各种现代药理作用研究。

与中药提取物直接作用相比，血清药理学进行体外细胞实验，不仅能够避免粗提制剂本身的理化性质可能对实验结果带来的干扰，且能模拟药物在体内经过的一系列复杂转化，使血清内既含有中药的原型成分，也含有代谢转化成分，还能反应复方配伍后的血药变化，尤其在口服药的研究过程中更为合理。

但血清药理学的使用，常受到多种因素的影响：①不同种属的实验动物对药物敏感程度不同，不同动物对不同药物的吸收和代谢速率不同;②药物的时效关系以及量效关系不好把控；③采血时间的选择、血清的制备方法、含药血清的处置、添加方式等问题仍有待解决。

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中药提取物/纯化物在体外细胞实验中如何使用？

中药提取物/纯化物易受到制剂的杂质、pH值、渗透压、电解质等因素影响，因此，在进行体外细胞实验前需要进行预实验摸索出适合细胞生长的浓度。首先，在溶解介质上主要选取适宜细胞生长的培养基或DMSO，选择适宜的溶媒后，对其进行等倍稀释以检测是否对细胞有毒性，随后筛选得到合适的浓度范围，再进行后续实验。

案例分析：

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中药含药血清最佳干预浓度如何筛选？

基于血清药理学为理论基础的体外细胞实验是研究中药药效机制的一种常见的研究方式，实验过程中筛选中药含药血清最佳干预浓度是整个实验的关键步骤。中药含药血清若稀释太过，或浓度太大，均可能导致出现假阴性或假阳性结果，最佳中药含药血清体积分数也可以减少后续实验分组数量，减少操作失误。

目前筛选方法主要有：①同剂量灌胃，同采血时间，不同体积分数。②不同剂量灌胃，同采血时间，同体积分数。③同剂量灌胃，不同采血时间，同体积分数。④不同剂量灌胃，不同采血时间，不同体积分数。⑤血清冻干粉干预法。⑥血清模拟西药体积分数梯度法。⑦纯血清干预法。其中①和②目前相关实验研究较为常用的方式。

①同剂量灌胃，同采血时间，不同体积分数。

②不同剂量灌胃，同采血时间，同体积分数

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中药含药血清浓度梯度如何设置？

依据大部分细胞的常规培养血清体积分数在2%～20%，因此，在中药体外实验研究中，常见中药含药血清的分组浓度大部分分布在这个范围。如SUN等将珍珠消积汤含药血清稀释成0、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%和20%的体积分数干预人肝癌细胞，筛选出17.5%体积分数被作为额外实验的最佳剂量（高剂量）。

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中药含药血清如何稀释？

中药含药血清或空白血清各浓度稀释配制方法：可以用完全培养基进行稀释配制，比如10%含药血清由10μL含药血清加完全培养基90μL配制而成。或是确保每组的反应体系中总血清体积分数为10%或20%，利用基础培养基和胎牛血清进行稀释配制，比如5%含药血清由5μL含药血清加胎牛血清5μL加基础培养基90μL配制而成。

案例分析：

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是否需要设置空白血清组？

动物血清本身含有许多活性物质，实验中需要严格设立空白血清组，以此来避免血清所含干扰性物质给实验结果带来的影响。一般在浓度初筛过程中，含药血清与空白血清设置相同的浓度梯度，以观察血清对细胞的影响。在后续的实验中，空白血清一般只选择一个浓度作为对照即可（一般与含药血清的高剂量浓度保持一致）

案例分析：

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不同的大鼠或小鼠提取得到的含药血清在进行细胞实验前，应做哪些准备，是否需要混合使用？

收集血液后，3000rpm，4℃，离心10min，分离血清。大部分研究人员对含药血清采用56℃水浴加热30min的灭活方式，可以除去血清本身含有的补体等干扰实验的活性成分；也有研究人员认为水浴灭活后可能会影响含药血清里面的有效生物活性，不进行灭活处理（为平衡这一矛盾，可设置空白血清组作为对照，或根据实验所选指标及药物本身的性质来综合判断含药血清是否需要灭活处理）。在进行细胞实验前，使用0.22μm的滤膜进行过滤除菌，防止后期培养细胞污染（若血清量不多，担心过滤后有太多损耗，可以在加入培养基稀释后，对培养基进行过滤除菌）。

对于血清是否需要混合使用，说法不一。有些研究人员建议混合使用，一是混合血清作用于细胞，可以消除组内大小鼠的个体差异，二是混合血清可以增加可用血清的用量（小鼠血清含量较少）。也有研究人员认为混样并不能减少差异，建议每组每只单独上样（建议有操作条件的课题组可以先对各组各只动物的血清进行初步筛选，后根据实际情况选择是否混合使用）。

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制备血清大概需要多少只大鼠（小鼠）？

一般一只大鼠（200g左右），采用腹主动脉采血的方式，采血量6mL左右，可以得到2mL左右血清。一只小鼠（20g左右），采用眼眶取血的方式，可以取全血1.0～1.5mL，可以得到大约0.2mL左右血清。根据实际的细胞实验，计算所需血清的总量，并进一步计算制备血清大概需要多少只大鼠（小鼠）。

参考文献：

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