《食品科学》：集美大学姜泽东教授等：红毛藻多糖抑制大肠杆菌黏附Caco-2细胞的机制

细菌引起的感染是全球范围内导致发病和死亡的主要原因。细菌黏附到宿主细胞表面是形成生物膜的初始步骤，也是导致细菌感染的必要条件。食物中的许多天然成分（如多糖）能够阻断细菌的侵染并发挥抗菌作用。

红毛藻（Bangia fusco-purpurea）又称为红毛菜，是我国东南沿海特有的经济红藻资源。红毛藻营养丰富、味道鲜美，同时也具有较高的药用价值。红毛藻多糖（BFP）是红毛藻中主要的膳食营养成分之一，单糖组成主要是半乳糖，还含有少量的糖醛酸、甘露糖和葡萄糖。人结肠腺癌细胞Caco-2细胞是目前研究细菌与肠道黏膜黏附作用应用最广泛的细胞模型。

集美大学海洋食品与生物工程学院的段舒舒、郑明静、姜泽东*等运用体外肠上皮细胞模型Caco-2细胞单层，探讨BFP对大肠杆菌黏附肠上皮细胞的影响及其潜在的作用机制，阐明红毛藻抗菌的食药用功效机理，为以红毛藻及其多糖为基料的新型食用抗菌剂的开发和应用提供理论参考。

1 E.coli及其培养上清液对Caco-2细胞活力的影响

前期研究表明，BFP在0～1000 μg/mL质量浓度范围内对Caco-2细胞无显著毒性作用。E.coli及其培养上清液在与Caco-2细胞共同孵育4 h和8 h后对Caco-2细胞单层中细胞活力的影响如图1所示。当E.coli（1×10 7 CFU/mL）和Caco-2细胞单层共同孵育4 h后，E.coli处理组、培养上清液处理组和BFP处理组中Caco-2细胞单层的细胞活力均未明显下降（图1A）；当与Caco-2细胞共同孵育8 h时，BFP对Caco-2细胞单层的细胞活力无明显影响，而E.coli处理组和培养上清液处理组中Caco-2细胞单层的细胞活力极显著下降（P＜0.01），分别达到（31.58±0.96）%和（42.44±2.53）%（图1B）。以上结果表明，共同孵育8 h，E.coli及其培养上清液对Caco-2细胞单层具有毒性作用；而E.coli及其培养上清液与Caco-2细胞共同孵育4 h时，不影响其细胞活力，因而本实验选择4 h作为黏附时间进行后续研究。

2 BFP对E.coli黏附Caco-2细胞单层的影响

基于CFDA SE的荧光标记法可用于定量分析细菌在细胞单层表面的黏附规律。BFP对E.coli黏附Caco-2细胞的影响结果如图2所示。0～200 μg/mL BFP处理组中的E.coli相对荧光强度没有显著变化，当BFP质量浓度为400 μg/mL时，相对荧光强度显著降低（P＜0.05）；当BFP质量浓度达到800 μg/mL时，相对荧光强度极显著下降（P＜0.01）。以上结果表明，BFP在0～200 μg/mL质量浓度范围内对E.coli黏附Caco-2细胞单层的能力无显著影响，而在BFP质量浓度达到400 μg/mL以上时能够显著抑制E.coli在Caco-2细胞单层上的黏附。

3 BFP对Caco-2细胞表面整合素β1的影响

整合素参与细胞黏附、迁移、增殖和血管生成等过程。整合素β1是最丰富的细胞表面整合素，一些病原体利用整合素β1作为黏附因子与宿主细胞紧密连接。BFP对Caco-2细胞表面整合素β1的影响如图3所示，利用E.coli及其培养上清液处理Caco-2细胞后，细胞表面整合素β1的基因表达水平没有显著的变化，但是经400 μg/mL BFP预处理Caco-2细胞后，E.coli及其培养上清液处理组中细胞整合素β1的基因表达均显著降低（P＜0.05、P＜0.01）。结果表明，BFP能够通过下调肠上皮细Caco-2细胞表面受体整合素β1的表达抑制E.coli对Caco-2细胞的黏附，这是BFP调控细菌黏附肠壁细胞的潜在作用机制之一。

4 BFP对E.coli表面黏附素基因fimH表达的影响

黏附素包括菌毛黏附素和非菌毛黏附素，其中I型菌毛黏附素是最主要的黏附因子。I型菌毛黏附素主要由fimH基因编码，fimH基因编码的FimH蛋白与黏附相关。通过干扰病原菌黏附素与宿主受体的结合，可以减少病原菌在宿主内的定植和生长，从而预防和治疗感染性疾病的发。BFP对大肠杆菌fimH基因表达的影响如图4所示。与CON组相比，BFP处理E.coli后fimH基因的表达水平极显著降低（P＜0.01），表明BFP能够通过下调黏附素相关基因的表达抑制细菌的黏附，同时也干扰细菌与宿主的接触，进而抑制生物膜的形成，防止细菌产生耐药性以及造成严重的感染。相关研究表明，FimH的抗体可以阻止尿路致病性大肠杆菌在膀胱上皮细胞定植，保护机体免受膀胱黏膜感染，这与FimH的抗体降低细菌对宿主上皮细胞的黏附密切相关综上所述，细菌黏附相关的基因fimH也是BFP抑制E.coli黏附以及细菌感染的关键靶点之一。

5 BFP对Caco-2细胞炎症因子表达的影响

炎症是宿主对微生物感染和组织损伤作出反应的一系列防御过程。长时间不受控制的炎症反应会给宿主细胞和组织带来损伤，导致一系列疾病的发生，如2型糖尿病、炎症性肠病等。本研究进一步探讨了BFP对E.coli及其培养上清液导致的肠上皮细胞炎症损伤的影响。如图5所示，在E.coli的作用下，未经BFP预处理的Caco-2细胞（CON组）中炎症因子基因IL-1β、IL-8、TNF-α表达水平均极显著升高（P＜0.01），而经BFP预处理的Caco-2细胞（BFP组）中炎症因子基因IL-1β、IL-8、TNF-α表达水平均极显著下降（P＜0.01），表明BFP能够显著下调E.coli诱导Caco-2细胞单层产生的细胞炎症因子水平。此外，在E.coli培养上清液的作用下，未经BFP预处理的Caco-2细胞（CON组）中IL-1β基因表达水平无明显上升，而IL-8和TNF-α基因表达水平极显著升高（P＜0.01）；经BFP预处理后Caco-2细胞（BFP组）中IL-8和TNF-α基因表达水平均显著下调。以上结果表明，BFP能够显著抑制E.coli及其培养上清液诱导Caco-2细胞产生的炎症因子表达水平，具有缓解肠道病原体诱导促炎细胞因子产生增加肠上皮通透性破坏肠道屏障，进而维持肠道健康的潜力。

6 BFP对Caco-2细胞单层中紧密连接蛋白基因表达和蛋白表达的影响

人体的肠道屏障是抵御肠道致病菌入侵的重要组成部分，当肠道菌群失调或病原菌入侵时，会导致肠道屏障的完整性被破坏。BFP对Caco-2细胞单层中紧密连接蛋白基因表达和蛋白表达的影响如图6所示。结果表明，E.coli及其培养上清液均能够显著降低Caco-2细胞单层中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的基因表达（P＜0.01）；其中，E.coli处理的Caco-2细胞单层ZO-1和Occludin基因表达下调程度高于其培养上清液；经BFP预处理后，Caco-2细胞单层的ZO-1基因表达水平极显著提高（P＜0.01）、Occludin 基因表达水平极显著提高（P ＜0.01）（图6A、B）。在紧密连接蛋白表达方面（图6C～E），经E.coli或培养上清液作用后，Caco-2细胞单层中ZO-1和Occludin蛋白表达极显著降低（P＜0.01）。相比空白对照组，实验对照组Caco-2细胞单层中ZO-1蛋白表达分别降低了92.30%和57.60%，Occludin蛋白表达分别降低了65.20%和61.50%。经BFP预处理后，与实验对照组相比，Caco-2细胞单层中E.coli及其培养上清液作用后ZO-1蛋白表达分别显著提升41.00%和17.70%，E.coli作用后下调的Occludin蛋白表达显著提升34.70%。以上结果表明，E.coli及其培养上清液能够通过下调紧密连接蛋白的表达水平破坏肠壁上皮细胞之间的紧密连接，进一步造成肠道屏障完整性的损伤，而BFP能够通过抑制E.coli及其培养上清液导致的Caco-2细胞单层紧密连接蛋白表达的下调，缓解肠壁上皮细胞之间的紧密连接的破坏，对于维持肠上皮屏障的完整性、抵御肠道致病菌入侵机体具有积极的作用。

7 讨 论

E.coli是食源性致病菌，在一定条件下能够引起人类和动物发生胃、肠道感染或尿道感染等多种疾病且手术风险大。E.coli黏附在宿主细胞表面是其形成生物膜甚至造成细菌感染的初始步骤和关键因素。大肠杆菌黏附真核细胞主通过其菌毛的表面蛋白质附属物和宿主细胞上的互补受体介导。宿主黏膜上皮细胞表面通常有黏附素受体，黏附素能够与上皮细胞表面的受体结合，从而使细菌牢固地附着在细胞表面上。细菌黏附宿主细胞不但使其更易于侵入宿主细胞进行生长繁殖，还能有效避免细菌被宿主免疫系统清除。

目前，天然食物中的抗致病菌黏附成分已经引起广泛的关注和研究。近年来，关于食源性多糖抗菌作用机制已有大量研究，其主要是通过破坏细胞膜、造成氧化应激等达到抗菌作用，然而针对食源性多糖特别是可食用海藻多糖的抗黏附作用机制鲜有报道。前期研究表明BFP通过破坏E.coli细胞膜增加活性氧含量、抑制生物膜形成以及调节相关通路发挥其抑菌作用，本研究通过探究BFP对E.coli黏附Caco-2细胞的影响，发现BFP能够抑制E.coli的黏附，因而进一步对E.coli表面黏附素以及Caco-2细胞表面整合素基因表达水平进行分析，结果表明BFP能够抑制两者的基因表达水平，这说明BFP可以对E.coli和细胞均发挥作用，阻止E.coli和Caco-2细胞的相互作用，此外，BFP还通过抑制E.coli感染引起的炎症反应保护Caco-2细胞。尽管本研究运用体外肠上皮细胞模型Caco-2细胞单层探讨并阐释了BFP对E.coli黏附肠上皮细胞的影响及其潜在的作用机制，但人体胃、肠道的环境是动态多维度的，多糖浓度、细菌浓度、黏附时间和内环境的变化等条件对E.coli黏附都会产生显著影响，因此后续基于体内实验探讨BFP对细菌感染的肠道组织或器官生理病理变化的影响，有利于进一步明确细菌对宿主的黏附状况并阐明其分子机制。

8 结 论

本研究从红毛藻中提取BEP，利用Caco-2细胞单层模型探究BFP对E.coli黏附肠上皮细胞Caco-2细胞单层的调控作用及其潜在机制。实验结果表明，BFP在400～800 μg/mL范围内对E.coli黏附Caco-2细胞单层具有显著的抑制作用，主要通过下调Caco-2细胞单层中细胞表面受体整合素β1的基因表达水平和下调E.coli黏附素基因fimH的表达抑制E.coli黏附肠上皮细胞单层。同时，BFP能够通过下调Caco-2细胞单层中细胞炎症因子基因（TNF-α、IL-1β、IL-8）的表达和上调紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin）的表达，减轻E.coli黏附导致的肠上皮细胞炎症反应和对肠上皮细胞屏障的损伤。本研究可为食源性多糖用于阻断细菌黏附从而预防细菌感染以及相关疾病提供理论基础，为红毛藻的精深加工和高值应用提供科学依据。

通信作者

姜泽东，集美大学海洋食品与生物工程学院教授，博士生导师、硕士生导师。 入选日本学术振兴会（JSPS）学者计划（2012年、2019年）、福建省高校新世纪优秀人才计划（2017年）等，主要从事食品生物技术领域的应用基础研究。先后主持3 项国家自然科学基金项目、2 项国家重点研发计划专项子课题、1 项福建省农业引导性（重点）项目等科研项目16 项；参与国家海洋公益性行业科研专项、福建省农业科技重大专项、福建省海洋与渔业厅重点专项等科研项目40余项。近5 年，发表学术论文60多篇（其中SCI收录50余篇）；以第一发明人授权国家发明专利7 件；转化成果2 项；获2022年度福建省科学技术进步一等奖（第一完成人）、2019年度中国商业联合会科学技术奖一等奖（第一完成人）、 “2021年度全省高校优秀共产党员”等荣誉。

第一作者

段舒舒硕士研究生 毕业于集美大学海洋生物与食品工程学院，食品科学与工程专业，研究方向为食品科学。

本文《 红毛藻多糖抑制大肠杆菌黏附Caco-2细胞的机制 》来源于《食品科学》2024年45卷17期 9-16 页。作者：段舒舒，郑明静，洪涛，朱艳冰，倪辉，姜泽东。DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20230719-204 。 点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心（动物替代蛋白）及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、西南民族大学药学与食品学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。

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