Mol Cell | Cas13b抑制因子AcrVIB1的独特机制—促进Cas13b-crRNA结合并加速crRNA降解

撰文 | 木兰之枻

抗CRISPR蛋白（Acrs） 是噬菌体为抵抗原核生物CRISPR-Cas免疫系统杀伤而演化出的CRISPR抑制因子【1】。Acrs研究可以加深并拓展我们对CRISPR-Cas系统的了解和认识，还能指导开发更加精准和安全的基因编辑工具，因此Acrs鉴定和机制解析是当下研究的热点。近年来研究者借助序列/结构特征分析和机器学习等策略已挖掘出上百种Acrs蛋白 （详见BioArt报道： ； ）【2-6】。研究发现，Acrs主要作用于Cas - RNA形成的核糖核蛋白 （RNP） 复合物来发挥抑制作用。例如，AcrIF1作用于Cas7f复合物，以阻断crRNA识别目标DNA；AcrIIA4与Cas9的PAM识别域结合，抑制后续的目标DNA识别过程；AcrVIA1与Cas13a中crRNA的暴露面结合，从而阻断crRNA与目标RNA的相互作用。除了作用于RNP复合物外，研究还发现AcrIIC2和AcrIIA17能够与Cas9结合，以阻断RNP复合物的形成，而AcrVA2则促进Cas12a 的mRNA降解以发挥抑制作用。除此之外，Acrs是否能通过其他未知机制抑制CRISPR-Cas系统的功能，仍有待进一步探索。

2025年2月17日，来自德国亥姆霍兹RNA感染研究所 (HIRI) 的Chase L. Beisel实验室与德国亥姆霍兹感染研究中心 （HZI） 的Wulf Blankenfeldt实验室合作，在Molecular Cell发表题为AcrVIB1 inhibits CRISPR-Cas13b immunity by promoting unproductive crRNA binding accessible to RNase attack的论文。文章对AcrVIB1蛋白抑制Cas13b的机制进行了深入研究，发现AcrVIB1能结合Cas13b，促进Cas13b-crRNA互作，并最终加速crRNA降解。总体而言，本研究揭示了Acrs抑制CRISPR-Cas功能的全新独特机制，进一步拓展了研究者对Acrs与CRISPR系统之间相互作用的了解和认识。

研究者前期工作指出，AcrVIB1主要通过干扰PbuCas13b与crRNA的结合而非传统所认为的对核糖核酸蛋白 （RNP） 复合物功能的抑制。本研究通过体外RNA旁切实验 （collateral RNA cleavage assay） 证实，AcrVIB1-Cas13b预混能有效抑制Cas13b的RNA切割活性；Cas13b-crRNA预混后加入AcrVIB1则无明显的抑制效果，这表明AcrVIB1是在RNP复合物形成前发挥抑制功能。机制研究发现，AcrVIB1能促进crRNA的降解，但不影响Cas13b的蛋白稳定性。此外，研究还指出，AcrVIB1能紧密结合Cas13b而非crRNA。

已有的机制研究指出，AcrIIC2和AcrIIA17能通过结合Cas9以抑制Cas9-crRNA复合物形成，因此研究者猜测AcrVIB1是否通过类似的机制抑制Cas13b功能。随后的微量热泳动 (MST) 和EMSA实验指出，AcrVIB1并不抑制Cas13b-crRNA复合物形成，反而有效促进了Cas13b与crRNA的结合。研究还发现，AcrVIB1能抑制Cas13b对crRNA的剪切加工能力，降低并改变Cas13b-crRNA复合物对目标RNA的结合特性，最终干扰Cas13b的RNA切割活性。随后的机制研究指出，AcrVIB1主要通过干扰Cas13b对crRNA的保护能力，最终加速RNA酶对crRNA的降解。

研究者还通过冷冻电镜三维重构和AlphaFold3结构预测，对AcrVIB1的机制进行了更深入的分析。结果显示，AcrVIB1能结合Cas13b的螺旋-2 （helical-2） 结构域并使之处于开放构象状态，进而促进了Cas13b与crRNA的结合。与此同时，由于AcrVIB1导致的Cas13b构象变化，与之结合的crRNA难以被Cas13b包裹保护，因此易被RNA酶降解。最后，研究者还通过蛋白突变实验证实了AlphaFold3预测AcrVIB1-Cas13b复合物结构的可靠性，证实了AcrVIB1抑制Cas13b功能的全新独特机制。

总体而言，研究者通过生化实验、冷冻电镜三维结构重构和AlphaFold3复合物结构预测，系统全面的探索了AcrVIB1抑制Cas13b的全新独特机制，为细菌-噬菌体的免疫-抗免疫演化研究提供了新的视角，并为未来CRISPR-Cas基因编辑活性的灵活调控提供了新的思路。

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2025.01.020

制版人：十一

参考文献

1. Bondy-Denomy, J., et al. (2013). Bacteriophage genes that inactivate the CRISPR/Cas bacterial immune system.Nature493, 429–432.

2. Gussow, A.B., et al. (2020). Machine-learning approach expands the repertoire of anti-CRISPR protein families.Nat. Commun.11, 3784.

3. Huang, L., et al. (2021). AcrDB: a database of anti-CRISPR operons in prokaryotes and viruses.Nucleic Acids Res.49, D622–D629.

4. Wang, J., et al. (2020). PaCRISPR: a server for predicting and visualizing anti-CRISPR proteins.Nucleic Acids Res48, W348–W357.

5. Wandera, K.G., et al. (2022). Anti-CRISPR prediction using deep learning reveals an inhibitor of Cas13b nucleases.Mol. Cell82, 2714–2726.e4..

6. Katz, M.A., et al. Diverse viral cas genes antagonize CRISPR immunity.Nature634, 677–683 (2024).

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