脑脊液的细胞游离DNA测序诊断出主要定位软脑膜的胶质母细胞瘤

研究概述

本研究报告了一例74岁男性患者的罕见胶质母细胞瘤，主要生长在软脑膜。患者表现出头痛、手抖和认知障碍，MRI显示脑干和小脑软脑膜增强，但未见明显的瘤块。细胞游离DNA（circulating free DNA, cfDNA）是指在血液或其他体液中游离存在的DNA片段。这些DNA片段通常源自多种细胞，包括肿瘤细胞、凋亡或坏死的正常细胞。cfDNA的分析在医学研究和临床诊断中具有重要意义。cfDNA可以用于检测肿瘤特异性突变，帮助诊断癌症、监测肿瘤进展和评估治疗反应。尽管传统细胞学分析未能检测到肿瘤细胞，通过脑脊液中的细胞游离DNA纳米孔测序，研究人员成功识别出TERT启动子突变和特征性的拷贝数变异。此方法显示了脑脊液DNA的潜力，作为一种快速且微创的诊断工具，为高级别胶质瘤的确认提供了有力证据。这一发现为临床医生在处理类似病例时提供了新的见解，也提供了明确的诊断依据，有助于制定后续的治疗方案。

病例报告

患者为74岁的男性，症状为头痛、手抖、步态不稳及认知障碍，并在前过去两个月内逐渐加重。患者既往有前列腺癌病史，5年前接受了放射治疗，2个月前在回肠末端发现神经内分泌肿瘤（neuroendocrine tumor，NET）1级。脑MRI显示：未见脑实质内病变，脑干、小脑及颅神经周围软脑膜可见强化（图1a）。当时的鉴别诊断包括“神经炎症性疾病”和转移性疾病（不除外前列腺癌的软脑膜转移和1级NET）。除回肠NET外，PET-CT扫描未发现颅外原发肿瘤或转移性病灶。腰椎穿刺获取的脑脊液显示白细胞数量轻度增加(14个细胞/µl），葡萄糖水平正常（2.9 mmol/l），总蛋白水平增加（8.75 g/l），与软脑膜转移性疾病一致。在第三次腰椎穿刺时，脑脊液的细胞学和循环肿瘤细胞分析仍然为阴性。然而，对cfDNA的下一代测序显示，端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase,TERT）启动子突变，加强了患者实际上患有软脑膜恶性肿瘤的假设。

图1：临床诊断学图。a MRI增强像显示小脑和脑桥周围的强化灶（I、II中的箭头）。两侧颅神经VII、VIII的强化（III中的箭头）。b脑脊液DNA测序所得序列reads的大小分布。c 通过纳米孔测序获得的CNV图谱。d肿瘤分类为胶质母细胞瘤-MID

研究者选择对脑脊液进行纳米孔测序。从2 ml的脑脊液中提取了约200 ng的DNA。使用调整后的文库准备方案，对100 ng的样本进行测序，得到1800万reads。映射的读长显示了cfDNA典型的大约 150个碱基对周期性（图1b），大部分片段在143-175个碱基对范围内。拷贝数变异（copy-number variation，CNV）特征（图1c）显示了出某些变化，包括PDGFRA和MDM4增益和CDKN2A/B损失，高偏差表明肿瘤分数高。在完整或下采样数据集上进行DNA甲基化分析，得到了胶质母细胞瘤、亚型中线（GBM-MID）的高可信度评分（图1d）。进行DNA甲基化分析确定了GBM-MID的分类以及CNV谱的改变。

考虑到颅内疾病和临床恶化，患者得到了最好的支持治疗。但是，患者的病情迅速恶化，很快就去世了。病理显示了分散性增厚和不透明软脑膜，尤其是在额叶（图2a)、小脑和脑干周围。肉眼观察未发现脑实质内有肿瘤肿块。在显微镜下，肿瘤细胞在整个软脑膜中广泛出现浸润（图2b）。显微镜下显示肿瘤在脑实质内略微生长，在脑室的室管膜下方（图2c、d）和中脑的皮质下方存在弥漫性浸润性生长。肿瘤细胞呈星形胶质细胞形态，细胞核高度不典型，染色质粗糙（图2d）。免疫组化证实了肿瘤的胶质性质（Olig2；图2e）。偶尔观察到有丝分裂象，但缺乏坏死和明显的微血管增生。值得注意的是，肿瘤细胞增殖活性通过Ki-67染色显示为中至高度（约20-30%；图2f）。这些病理结果结合TERT启动子突变的鉴定，使得可以进行胶质母细胞瘤（IDH野生型）的组分子诊断，这与患者生前脑脊液纳米孔测序所建议的诊断完全一致。

图2：病理。脑切片显示软脑膜浑浊增厚（a，白色箭头）。显微镜下，非典型细胞弥漫分布在软膜腔内（b）。在某些区域，这些细胞也略微存在于室管膜下/脑室周围，例如靠近海马（c，d，方框），在相邻的深层脑沟中，这些细胞的积累更为密集（*）。Olig-2（e）和Ki-67（f）的免疫组化染色分别确认了肿瘤的胶质性质和增殖活性。L：软膜；CTX：大脑皮层的分子层；HE：苏木精-伊红染色。

1.研究者报告了一例IDH野生型胶质母细胞瘤，其主要生长在软脑膜。这类病例既往很少有报道，诊断非常具有挑战性。利用脑脊液cfDNA的纳米孔测序，进行DNA甲基化分类是一种快速和微创的方法，以获得直接的诊断建议。

2.研究者假设从脑脊液中回收的大量肿瘤DNA是由于肿瘤细胞与脑脊液之间的大面积地接触。在小且局限性的肿瘤中，cfDNA的获取和测序可能更具挑战性。TERT启动子突变的发现、CNV特征的变化以及高置信度的分类为高级别胶质瘤/胶质母细胞瘤的诊断提供了充分的证据。

3.准确的诊断对患者及其家属非常有帮助，因为这为继续进行姑息治疗奠定了基础。

参考文献：Sol Nik,Kooi Evert-Jan,Pagès-Gallego Marc et al. Glioblastoma, IDH-wildtype with primarily leptomeningeal localization diagnosed by nanopore sequencing of cell-free DNA from cerebrospinal fluid.[J] .Acta Neuropathol, 2024, 148: 35.