Adv Sci丨单细胞配对蛋白质组学：开放式微流控技术赋能精准单细胞互作研究

近年来，单细胞分析技术得到了广泛的发展，已逐步实现细胞异质性的多维度深度解析。然而，细胞间的复杂相互作用同样受到细胞异质性的影响。传统的细胞相互作用研究通常基于群体细胞进行，无法评估细胞异质性对细胞互作的影响【1】，因而，开展单细胞水平的靶向配对及互作研究具有重要意义，但仍面临诸多技术挑战。目前，单细胞配对的实现主要基于封闭式微流控芯片技术和随机液滴配对技术，受限于高难度的芯片加工与配对的随机性，限制了其在单细胞靶向配对与互作机制研究中的广泛应用。如何实现“任意指定A细胞+B细胞”的配对及细胞互作的多维度深度表征，是亟待突破的关键技术难题。

近日，来自浙江大学化学系的方群教授团队在Advanced Science杂志上发表了文章Single cell-pair proteomics for decoding immune-cancer cell interactions，他们开发了一种基于自动化机器人技术和微流控液体操控技术的高精度单细胞靶向配对平台，并应用于成对单细胞的活细胞实时显微成像和蛋白质组学分析，在单细胞水平上实现细胞间相互作用的多维度表征与机制研究。在单细胞蛋白质组学方面，基于同位素代谢标记方法，首次在成对单细胞中实现了超过1000种蛋白质的鉴定深度，为单细胞靶向配对与互作机制研究提供了重要的技术手段和平台。

团队开发的单细胞靶向精准配对平台充分发挥了开放式微流控技术操作灵活、简便、多多功能的优势，实现单细胞靶向捕获、精准配对和无损回收的技术突破。基于该平台的单细胞“捕获”、“配对”和“回收”可以作为三个基元操作，分别与共聚焦荧光显微成像、活细胞工作站共培养、LC-MS/MS分析等模块灵活组合，首次实现了成对单细胞相互作用行为实时监测和深度蛋白质组学分析的共同表征，并表现出与其他多维度分析模块整合的巨大潜力，有望实现成对单细胞互作行为的多模态表征研究。

该平台由单细胞配对操控模块、活细胞共培养和共聚焦荧光显微监测模块、单细胞蛋白质组学分析模块三部分组成。其中，单细胞配对操控模块是平台的核心，基于研究团队自研的序控液滴阵列 （SODA） 技术开发构建，主体为自动化微流控液体操控机器人，利用毛细管探针与纳升级流体控制泵，实现“所见即所得”的单细胞靶向捕获、精准配对和无损回收。在对该平台的测试与评估中，其单细胞配对的成功率高达95%，最高配对速度为60 s/对，单细胞配对前后的细胞活性无显著变化，并且能够实现目标单细胞对的全回收。基于明场与荧光显微成像功能，可实现单细胞外观形态、活性状态的实时监测，获得目标单细胞的表观形态学信息。

图1. 单细胞对蛋白质组学技术解码免疫-肿瘤细胞相互作用流程示意图

针对癌症免疫疗法 （CIT） 临床治疗中存在的个体肿瘤与免疫反应异质性问题【2, 3】，研究团队将单细胞靶向精准配对平台应用于免疫细胞与癌细胞相互作用的研究，在单细胞水平解析细胞异质性对免疫肿瘤互作反应的影响，为提高CIT临床治疗的有效性提供技术与方法学基础。采用NK92MI免疫细胞和K562肿瘤细胞的单细胞靶向配对模型，共收集了100组NK92MI-K562细胞对，进行单细胞免疫肿瘤相互作用的行为研究。基于荧光显微成像的延时动态录像结果表明，免疫-肿瘤细胞对的自然杀伤行为存在异质性，约有24%的肿瘤细胞被成功杀伤，并且观察到极少数免疫细胞凋亡的情况，在单细胞水平上验证了NK细胞的细胞毒性异质性。

在免疫-肿瘤细胞对的单细胞蛋白质组学分析中，研究团队创新性地利用SILAC稳定同位素代谢标记方法，对细胞对中每个细胞的蛋白质组学信息进行解耦独立分析。该方法先采用包含同位素标记试剂 （本实验选择13C615N4-Arg 和13C615N2- Lys） 的细胞培养基，对其中一种目标细胞进行孵育，并验证同位素标记效率高于95%时进行细胞配对和互作研究。基于非同位素 （Light） 和同位素 （Heavy） 标记的区别，可通过软件分析和解耦质谱数据来获取目标细胞对中单个细胞相对应的蛋白质组表达谱信息。基于数据非依赖性采集 （DIA） 质谱方法在单细胞蛋白质组分析中的优势，研究团队突破DIA采集模式在SILAC标记质谱数据解耦中的数据分析瓶颈，对43组标记的NK92MI-K562细胞对进行基于SILAC的细胞对蛋白质组学分析：在10个细胞毒性细胞对中平均鉴定出1163±62个蛋白质组，在33个非细胞毒性细胞对中平均鉴定出1227±91个蛋白质组。通过不同的标记通道区分和定量不同细胞来源的蛋白质表达，从而在单细胞水平上分析与不同细胞表型相对应的差异蛋白质表达。这种方法不仅能够精确且全面地分析细胞对的深度蛋白质组学信息，还发现了具有不同功能的NK细胞亚群，并鉴定出癌症治疗的重要生物标志物。这表明该平台在剖析免疫细胞与肿瘤细胞相互作用，分析免疫反应异质性以及预测癌症免疫治疗中的生物标志物方面具有独特的能力，能够提供更丰富且全面的蛋白质组数据集。

总结而言，该平台为单细胞相互作用的多维度表征和机制研究提供了一种全新的有力手段。它作为一种有效的单细胞配对和分析工具，依托单细胞“捕获”、“配对”和“回收”的三个基元操作，在精确性、实用性和兼容性方面具有显著优势。未来可以在此平台基础上结合多组学分析方法，以更全面地理解免疫反应异质性的分子基础，有助于发现有价值的生物标志物，并为开发新的、更有效的癌症治疗手段奠定分子基础。

本文共同第一作者为浙江大学化学系博士生许钦沁、浙江大学化学系博士后蒋易蓉，共同通讯作者为浙江大学化学系方群教授、浙江大学化学系潘建章副研究员、浙江大学杭州国际科创中心杨奕博士。

原文链接：https://doi.org/10.1002/advs.202414769

制版人：十一

参考文献

1. R. Satija, A. K. Shalek,Trends Immunol.2014, 35, 219.

2. O. K. Dagher, R. D. Schwab, S. K. Brookens, A. D. Posey Jr.,Cell2023, 186, 1814.

3. P. S. Hegde, D. S. Chen,Immunity2020, 52, 17.

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