NAR丨郭骏杰/陈硕斌团队开发基于RNA G-四链体的新型PROTAC用于rG4结合蛋白降解及基因调控

RNA G-四链体 (rG4) 是广泛存在于转录组中的非典型二级核酸结构，通过与rG4结合蛋白 (G4BPs) 相互作用，在生命体基因调控过程中起着至关重要的作用，rG4-G4BP复合体已成为备受关注的药物靶点。 开发创新的工具干预rG4-G4BP 相互作用将为阐明生物学机制和治疗相关疾病提供新的契机。

近日，香港城市大学郭骏杰副教授与中山大学陈硕斌副教授团队，在Nucleic Acids Research期刊在线发表了RNA G-quadruplex structure-based PROTACs for targeted DHX36 protein degradation and gene activity modulation in mammalian cells的论文。研究团队开发了新型rG4-PROTACs嵌合体分子，证明了以非经典结构核酸rG4介导的靶向蛋白降解策略的可行性，系统分析表明rG4- PROTACs主要和选择性地降解DHX36，进而促进mRNA中rG4结构的形成，导致含有rG4的转录物的翻译抑制，为rG4-G4BP相互作用的深入研究和治疗G4BPs异常引起的疾病提供新思路。

研究团队开发的rG4-PROTACs由两个配体分子和linker共价连接：rG4分子结合靶蛋白，E3配体招募E3连接酶，导致rG4结合蛋白DHX36多泛素化，进而通过26S蛋白酶体途径降解。作者使用了两个已被广泛验证的E3招募小分子，AHPC (VHL E3招募分子) 和Pomalidomide (Cereblon E3招募分子) ，合成了多种linker （X：C6和PEG2） 的衍生物。已有研究表明DHX36可与平行链hTERC rG4特异性结合，因此作者选择hTERC rG4作为靶向G4BP的弹头，同时设计了突变序列rG4 mut，将形成RNA G-四链体的关键碱基G突变成A进而无法形成G4。AHPC-X-N3/Pomalidomide-X-N3与5’Hexynyl_hTERC rG4通过Cu(II)-TBTA介导的click反应，得到rG4-PROTACs (rG4_A, rG4_A_C6 , rG4_P_PEG2 , rG4_P_C6 , rG4 mut_A, rG4 mut_A_C6 , rG4 mut_P_PEG2 , and rG4 mut_P_C 6 ) ，变性凝胶分析合成产率可高达92%-97%。EMSA亲和力结果显示，相比与其它E3 配体衍生物，rG4_A_PEG2 (rG4_A) 与RHAU53多肽的亲和力最强 （Kd = 67.5 ± 13.2 nM） ，并且是已报道的dG4-PROTACs (dG4_A) 的4.7倍，表明rG4-PROTACs是识别G4BP的强效工具。

作者评估了rG4-PROTACs在细胞中降解DHX36蛋白的能力。在不同浓度rG4_A处理细胞后，在31至125 nM观察到最高的DHX36降解 (超过80%) 。rG4_A的时间依赖性显示，用50 nM的rG4_A处理细胞6 h内，DHX36的消耗已超过50%，在48 h时DHX36达到最大程度的降解效果，而rG4 mut-PROTACs无法降解DHX36蛋白，表明DHX36与rG4的结合强烈依赖于G4结构，并能在细胞中有效降解DHX36蛋白。另外，作者对rG4-PROTACs处理后的细胞进行了蛋白组学分析，在8000个定量蛋白中，检测到44个下调蛋白，DHX36是rG4_A处理后降解最显著的蛋白之一，rG4 mut_A处理组无明显差异。与此同时，作者发现其他一些已被证明的G4BPs，如 NCL (nucleolin) , DHX9, hnRNP (the heterogeneous nuclear ribonucleoproteins) , SRSF (serine / arginine-rich splicing factors) 和FMR1 (Fragile X-related Protein1) 没有显著变化，进一步证明rG4_A对DHX36的靶向作用具有高度特异性。

接下来，作者探索了rG4-PROTACs调控DHX36介导的下游rG4基因表达的应用。DHX36是一种DEAH-box RNA解旋酶，具有rG4结合和分解活性，rG4-PROTAC会诱导更多的G4形成，从而抑制蛋白表达。研究结果表明rG4-PROTAC能够调控3’UTR rG4的动态折叠，抑制内源性和过表达质粒APP蛋白。更重要的是，我们首次在小鼠骨骼肌细胞 (skeletal muscle cells) 中通过PROTAC技术降解DHX36蛋白，促进Gnai2 (guanine nucleotide-binding protein G(i) subunit alpha-2) 5’UTR rG4形成，引起Gnai2蛋白翻译抑制，从而调控了骨骼肌干细胞的增殖能力。

此研究通过非经典核酸二级结构rG4作为蛋白酶体降解嵌合分子的靶蛋白弹头，开发了靶向DHX36的rG4-PROTACs，深入研究了rG4-PROTACs的细胞调控功能。研究团队未来将继续推动rG4与G4BPs相互作用机制的研究和基于蛋白酶体的创新工具的研发。

香港城市大学郭骏杰副教授、中山大学陈硕斌副教授为该论文通讯作者。香港城市大学张坤博士，博士生聂启昌，中山大学李茂林博士为该论文的共同第一作者。香港中文大学王华婷教授和陈晓娜博士为本研究提供了重要支持。

原文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkaf039

制版人：十一

BioART战略合作伙伴

（*排名不分先后）

BioART友情合作伙伴

（*排名不分先后）

转载须知

【非原创文章】本文著作权归文章作者所有，欢迎个人转发分享，未经作者的允许禁止转载，作者拥有所有法定权利，违者必究。

BioArt

Med

Plants

人才招聘

会议资讯

近期直播推荐