江南大学酶工程实现Reb M9生产，解决苦味与低效难题

甜菊糖苷 M9（简称 Reb M9）是一种主要通过酶催化合成的非天然甜菊糖苷衍生物，其甜度可达蔗糖的 300-450 倍且具有零热值特性，在食品、饮料及医药工业中展现出重要的应用潜力。与传统糖类不同，Reb M9 对血糖代谢无显著影响，成为糖尿病管理及体重控制领域的理想候选分子。然而，尽管在感官特性和功能性方面具有显著优势，Reb M9 的产业化仍受限于两大关键缺陷：C-13 位点糖基化不足导致的残留苦味，以及分子极性分布不均引起的低水溶性（<1 g/L）。

值得注意的是，甜菊糖苷的味觉特性与其糖基化模式密切相关。已有研究表明，C-13 位点的 β-1,6-O-糖基化可显著掩蔽苦味受体的激活，而糖链的空间延伸则能通过增加分子亲水性提升溶解度。

基于此，江南大学研究团队提出了一种结构导向的酶工程策略：通过理性设计糖基转移酶 UGT94E13 的底物结合域，实现对 Reb M2（前体化合物）的定点糖基化修饰，从而定向合成高纯度Reb M9。该研究不仅将 UGT94E13 的催化效率提升 12 倍，更通过构建蔗糖合酶（AfSuSy）耦合的级联反应体系，将产物效价提升至 42.8 g/L，为甜菊糖苷的工业化生产提供了革新性解决方案。该成果以“Highly Efficient Biosynthesis of Rebaudioside M9 through Enzyme Screening and Structure-Guided Engineering”为标题发表在 Journal of Agricultural and Food Chemistry 上。

在 Reb M9 的生物合成中，糖基转移酶（GT）是关键催化剂，通过糖基化反应调控产物的理化特性。UGT 家族酶通过转移 UDP-葡萄糖的糖基至特定受体分子，决定了产物的糖基化模式。研究团队通过系统发育分析与底物结构比对，从 10 种候选糖基转移酶中筛选出UGT94E13。体外实验表明，UGT94E13 能够特异性催化前体化合物 Reb M2 的 C-13 位点进行 β-1,6-O-糖基化，生成 Reb M9。通过 LC-MS 与二维核磁共振验证，UGT94E13 能精准将葡萄糖单元引入 C-13 位点，形成 β-1,6 糖苷键，避免了其他潜在位点（如 C-19 或 C-2'）。

UGT94E13 的催化机制分析表明，酶的活性中心通过氢键稳定底物构象，辅助因子UDP-葡萄糖的结合由 Asp174 和 Arg182 调控。该酶的催化效率较高，为后续的酶工程优化提供了理论基础。此外，UGT94E13 的底物结合特性表明其可能源于趋异进化过程中的适应性变异，为非天然产物合成酶的开发提供了新思路。

尽管野生型 UGT94E13 可实现 Reb M9 的定向合成，但其催化效率难以满足工业化需求。为此，研究团队采用结构导向酶工程策略，通过理性设计优化酶活性。基于AlphaFold 2 预测的 UGT94E13 三维结构，分子对接分析发现活性中心附近的 F169 与 I185 残基可能通过空间位阻限制底物结合。将二者突变为丙氨酸（F169A/I185A）后，酶活性中心容积扩大，底物 Reb M2 的 C-13 羟基与 UDP-葡萄糖 C1 原子的距离缩短 0.32 Å。分子动力学模拟进一步表明，突变体催化反应的关键过渡态能垒显著降低。改造后，催化效率较野生型提高 11.3 倍。此外，突变体在连续反应中保持>90% 活性，展现出优异的操作稳定性。该结果证实，通过靶向调控底物结合域的疏水相互作用，可突破天然酶的催化瓶颈，为工业级酶设计提供了范式。

图|利用分子对接技术分析 UGT94E13 的结构，并根据分析结果进行结构改造，以提高其催化活性（来源：上述论文）

尽管 UGT94E13-F169A/I185A 的催化效率显著提升，但 Reb M9 的规模化生产仍受限于 UDP-葡萄糖（UDPG）的高成本与快速消耗。为此，研究团队构建了蔗糖合酶（AfSuSy，来源于拟南芥）与突变体的级联反应系统，通过蔗糖驱动的辅因子再生策略降低生产成本。在该系统中，AfSuSy 首先催化蔗糖分解为果糖和 UDPG，后者作为糖基供体被 UGT94E13-F169A/I185A 用于 Reb M2的C-13 糖基化，形成自给式代谢循环。

通过响应面法优化反应参数，团队发现，在 pH 6.5（磷酸钾缓冲液）、35°C、600 mM 蔗糖及 30 mM Reb M2 的条件下，级联系统的 UDPG 再生效率达 92.4%，显著高于传统外源添加模式（<30%）。最终，20 L 规模反应体系中 Reb M9 的产量提升至 42.8 g/L，产物纯度达 98.3%，较野生型系统提高 4.2 倍。该策略通过底物通道效应减少了中间产物扩散损耗，同时利用蔗糖的低成本优势，使 Reb M9 的生产成本降低 76%。这一突破性进展为莱鲍迪苷的工业化生物制造提供了经济可行的技术路径。

图|展示了优化 UGT94E13-F169A/I185A-AtSuSy 酶级联反应生产 Reb M9 的条件，并比较了野生型和突变体的催化活性（来源：上述论文）

在完成 Reb M9 的高效合成后，研究团队通过电子舌系统量化评估其感官特性。测试发现，Reb M9 的甜味更纯净，苦味几乎消失。这意味着，未来的无糖可乐或糖尿病友好食品中，可能会用上这种“升级版”甜菊糖。

该研究不仅证实了结构导向酶工程在糖苷功能优化中的普适性，更通过“酶设计-合成-验证”闭环策略，实现了Reb M9 从实验室合成到工业化应用的全链条突破。基于此，未来可针对不同食品基质（如酸性饮料或烘焙制品）定制糖基化模式，开发系列低苦味、高溶解度的天然甜味剂，推动清洁标签食品的创新发展。

1.Guo X, Zhang Y, Deng Z, et al. Highly Efficient Biosynthesis of Rebaudioside M9 through Enzyme Screening and Structure-Guided Engineering[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2025.

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