Adv Sci | 中国药科大学团队揭示葛根素促进肠共生菌生长改善高血糖和肝脏代谢紊乱

越来越多的证据表明，肠道微生物群在 T2D 的进展中发挥着至关重要的作用。控制肠道微生物群可能为对抗 T2D 提供一种新的、安全的治疗方式。来自多形拟杆菌的二肽基肽酶 4可降解胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)，从而影响血糖稳态。来自两个独立中心的 T2D 小鼠和患者的粪便样本中肠道共生菌Barnesiella intestinihominis ( B. intestinihominis ) 的丰度显著降低。B. intestinihomini是一种厌氧专性革兰氏阴性共生体，关于B. intestinihomini在 T2D 中的作用的报道很少。

2024年12月31日，中国药科大学天然药物国家重点实验室李萍/周伟团队在Adv Sci在线发表题为“Gut Commensal Barnesiella Intestinihominis Ameliorates Hyperglycemia and Liver Metabolic Disorders”的文章。肠道B. intestinihominis在T2D患者粪便中的丰度显著降低。口服LBI显著改善了HFD/STZ诱导的T2D模型和db/db小鼠的高血糖和肝代谢紊乱。机制研究表明，B. intestinihominis产生的醋酸盐通过抑制HDAC9增加成纤FGF21的表达，从而改善T2D。此外，从葛根芩连汤中筛选出的天然产物葛根素（puerarin）通过促进B. intestinihominis的生长，在肠道菌群依赖的方式下改善高血糖和肝代谢紊乱。

摘要

最近的研究强调了肠道微生物群在2型糖尿病（T2D）中的作用。改善肠道菌群失调可能是预防和治疗2型糖尿病的潜在策略。本研究发现2个独立研究中心的2型糖尿病患者粪便中Barnesiella intestinal hominis的丰度显著降低。在HFD/ stz诱导的T2D模型和db/db小鼠中，口服活B. intestinihominis（LBI）可显著改善高血糖和肝脏代谢紊乱。lbi衍生乙酸盐对T2D具有类似的保护作用。在机制上，醋酸盐通过抑制组蛋白去乙酰化酶9 （HDAC9）增加FGF21启动子区H3K27乙酰化来增强FGF21。葛根芩连汤中筛选出的葛根素以肠道菌群依赖的方式通过促进B. intestinihominis生长改善高血糖和肝脏代谢紊乱。这项研究表明，肠道共生的B. intestinihominis和葛根素分别具有作为益生菌和益生元治疗2型糖尿病的潜力。

1 T2D 小鼠和患者中B. Intestinihominis丰度降低

为了确定 T2D 中潜在的有益微生物组，使用了 HFD/STZ 小鼠模型（图 1）。接下来，我们对普通小鼠和HFD/STZ小鼠的粪便样本进行了16S rRNA基因测序分析。HFD/STZ不影响α多样性，而主成分分析（PCoA）显示两组之间有粪便微生物分离（图1B）。HFD/STZ小鼠在门和属水平上有明显改变，firmicutes - bacteroidetes比率较高（图1C-E）。为了确定哪些肠道菌群成员在T2D中起主导作用，我们进行了线性判别分析效应量（LEfSe）。在属水平，在HFD/STZ小鼠中，Allobaculum、Barnesiella、Clostridium_XlVa和Bifidobacterium的丰度降低，而Acetatifactor、Desulfovibrio和Alistipes的丰度增加（图1F）。重要的是，我们发现Barnesiella属的丰度与多个代谢参数（包括空腹血糖、HOMA-IR指数、OGTT、ITT、TC和TG水平）呈负相关(图1G)。在巴尔内氏菌属中鉴定出3种巴尔内氏菌，分别为人肠巴尔内氏菌、内脏巴尔内氏菌和丙酸巴尔内氏菌。在HFD/STZ小鼠的粪便样本中，肠人芽胞杆菌显著减少，且肠人芽胞杆菌的丰度与多个代谢参数呈负相关(图1H，I)。

此外，我们对来自南京中医药大学附属南京中医药医院的30名健康受试者和31例T2D患者进行鸟枪宏基因组学研究，发现肠道菌群丰度存在显著差异。(图1 j, K)。LEfSe分析显示，Barnesiella在属水平的丰度及其b种。人肠蛋白在T2D患者的粪便样本中减少，并且与餐后2小时血糖（2hPBG）和糖化血红蛋白（HbA1c）呈显著负相关(图1M，N)。此外，我们的qPCR结果表明，在T2D患者的粪便样本中，人肠杆菌丰度显著降低(图1o，P)。此外，比较了ggmrepo数据库中Barnesiella属和肠道人芽孢杆菌（B. intestinal hominis）的粪便丰度与健康受试者相比，T2D患者的Barnesiella和b.t iinihominis（图1Q，R）水平较低。因此，人肠杆菌可能与T2D的病理进展有关。

图1 T2D 小鼠和患者体内肠杆菌丰度降低

2 口服活B. Intestinihomini可改善 HFD/STZ 小鼠的高血糖和肝脏代谢紊乱

为了研究肠B. Intestinihomini是否可以缓解高血糖和肝脏代谢紊乱，HFD/STZ小鼠通过每日口服灌胃活B. Intestinihomini（LBI）和热灭活B. Intestinihomini（KBI）治疗6周（图 2A）。口服 LBI 提高了HFD/STZ 小鼠肠道中的肠杆菌水平。在 KBI 处理的 HFD/STZ 小鼠中， B. intestinihominis的丰度保持不变（图2B）。口服 LBI 可以减轻空腹血糖水平、血清胰岛素水平、HOMA-IR 指数以及 OGTT 和 ITT 结果（图 2C-G）。此外，LBI 治疗还降低了肝脏重量和肝脏重量/体重比，并改善了血脂异常（TG 和 TC）（图 2H）。与普通小鼠相比，HFD/STZ 小鼠的 NAS 较高，表明 HFD/STZ 小鼠存在肝脏脂肪变性和损伤。口服 LBI 可减轻 HFD/STZ 小鼠的肝脏脂肪变性和损伤（图 2I）。然而，KBI 治疗对血清胰岛素水平、OGTT 和 ITT 结果、肝脏重量、血脂异常、肝脏脂肪变性和损伤、ALT 和 AST 水平没有影响（图 2D，F-I）。这些发现表明，LBI 对 T2D 小鼠的高血糖和肝脏代谢紊乱有益且具有保护作用。

鉴于 T2D 通过肠道生命轴与肠漏相关，我们在 HFD/STZ 诱导的小鼠模型中检查了 LBI 对肠道屏障功能的影响。口服LBI显著降低血清中的脂多糖（LPS）水平（图 2J）。结肠组织的组织学染色显示，与HFD/STZ小鼠相比，LBI能够维持肠道上皮屏障功能（图 2K）。HFD/STZ 小鼠中 Occludin 和 ZO-1 的上皮表达显着下调，而 LBI 的给药可逆转这种抑制（图 2L-Q）

图2 口服 LBI 可减轻 HFD/STZ 小鼠的代谢紊乱和肠道屏障功能障碍

3.B.Intestinihomini衍生乙酸盐反映了有利作用

我们进行了非靶向代谢组学，以评估不同的粪便代谢谱(图3A，B)。与HFD/STZ小鼠相比，LBI口服给药显著调节了19种代谢物(图3C)。值得注意的是，乙酸是最丰富和显著富集的代谢物，与注释的前5条KEGG通路中的大多数相关，如丙酮酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢(图3D)。醋酸盐是肠道微生物发酵的最终产物之前的报告已经揭示了醋酸盐在减轻代谢性疾病方面的益处。在本研究中，HFD/STZ小鼠的粪便和肝组织中乙酸盐水平显著降低，而使用基于gc - ms的靶向代谢组学技术，LBI治疗显著上调(图3E，F)。此外，我们使用非靶向代谢组学评估了健康受试者和 T2D 患者之间粪便代谢特征的差异，并确定了 19 种差异代谢物（图 3G、H）。值得注意的是，使用靶向代谢组学，T2D 患者粪便样本中的乙酸盐水平显着降低，并且 T2D 患者的乙酸盐水平也显着低于健康受试者的水平（图 3I）。乙酸水平与B. intestinihominis、2hPBG 和 HbA1c 显著相关（图3J-L）。与B. intestinihomini体外孵育 48 小时后，与载体对照相比，乙酸盐在上清液中显著积累（图 3M）。Wood-Ljundahl 途径是肠道微生物产生乙酸的主要途径。乙酸通过 2 个分支合成：1) 通过将 CO 2还原成甲酸盐的 C1 体分支和 2) 通过 CO 2还原的一氧化碳分支CO，进一步与甲基结合生成乙酰辅酶A。乙酰辅酶A由磷酸乙酰转移酶（pta）和乙酸激酶（ackA）催化，其中ackA控制乙酸的最终产生（图 3N）。我们观察到 LBI 给药后 ackA 的活性和表达显著增加（图 3O，P）。因此， B. intestinihominis丰度的减少更有可能导致乙酸盐产量的减少。

图3 代谢组学鉴定了B.Intestinihomini衍生的代谢物

用乙酸盐孵育 24 小时，通过抑制 PA 诱导的原代肝细胞、HepG2 细胞和 HL-7702 细胞中的糖异生和增加糖原合成，显著降低肝葡萄糖水平（图 4A-C）。醋酸盐的施用降低了 HFD/STZ 小鼠的空腹血糖水平、胰岛素水平和 HOMA-IR 指数，并改善了 OGTT 和 ITT 结果（图 4D-I）。它显著改善肝脏代谢紊乱，如肝脏重量、肝脏重量/体重比、病理改变、脂质含量（TG 和 TC）以及 AST 和 ALT 水平所示（图 4J-P）。乙酸降低了 HFD/STZ 小鼠的血清 LPS 水平并改善了肠道屏障结构（图 4Q-T）。总而言之，这些结果表明乙酸盐是B.Intestinihomini的功能代谢产物，可改善高血糖和肝脏代谢紊乱以对抗 T2D。

图4 乙酸减轻了 HFD/STZ 小鼠的代谢紊乱和肠道屏障功能障碍

5 B.Intestinihomini衍生的乙酸通过 HDAC9 激活 FGF21 基因转录

对饲料组、HFD/STZ 组和醋酸盐治疗组的肝组织进行 RNA 测序。HFD/STZ 治疗导致 1434 个基因上调和 513 个基因下调。口服醋酸盐显著上调224个基因并下调311个基因（图 5A）。GO分析显示改善高血糖和肝脏代谢紊乱的机制与组蛋白去乙酰化有关，并且Hdac9被乙酸盐显著下调（图 5B，C）。醋酸盐处理后证实了肝脏和 HepG2 细胞中 HDAC9 mRNA 和蛋白水平的下调（图 5D-F）。接下来，我们研究了肝脏 HDAC9 在醋酸盐调节代谢紊乱过程中的作用。HDAC9的过表达消除了PA诱导的HepG2细胞中乙酸盐的保护作用（图 5G-I），但HDAC9 siRNA显著逆转PA诱导的HepG2细胞中的糖异生、葡萄糖消耗和糖原合成（图 5J –L）。成纤维细胞生长因子21（FGF21）在肝脏中大量表达，与代谢疾病密切相关。先前的研究报道HDACs可以通过促进FGF21启动子区域的组蛋白乙酰化来上调FGF21的表达。在这项研究中，B. intestinihominis及其衍生的乙酸盐显著上调 HFD/STZ 小鼠中的 FGF21 水平（图 5M,N）。在PA诱导的HepG2细胞中，我们发现HDAC9的过度表达消除了乙酸盐对FGF21的上调（图 5O）。类似地，HDAC9 的敲除上调 FGF21（图 5P）。更重要的是，ChIP-qPCR 分析显示乙酸盐上调 FGF21 启动子处的组蛋白 H3K27 乙酰化（图 5Q）。总体而言，这些数据表明源自肠人芽孢杆菌的乙酸盐上调 FGF21 启动子区域的组蛋白乙酰化，并通过抑制 HDAC9 的表达来促进 FGF21 的转录。

图5 乙酸通过下调 HDAC9 激活 FGF21 基因转录

6 通过促进B. Intestinihominis生长来筛选改善高血糖和肝脏代谢紊乱的调节剂

我们从 T2D 相关草药（葛根芩连汤）中筛选出 48 个成分，以促进B. Intestinihominis生长。葛根素具有最强的促进B. intestinihominis生长的能力。为了研究葛根素的代谢保护作用是否依赖于肠道微生物群的存在，我们用抗生素混合物治疗 HFD/STZ 小鼠（图 6A）。这些结果表明，葛根素引起的高血糖和肝脏代谢紊乱的改善在抗生素鸡尾酒干预下被消除（图 6B-F）。HDAC9和FGF21表达的逆转也被阻断（图 6G）。此外，我们将葛根素处理的 HFD/STZ 小鼠的微生物群转移到传统的 HFD/STZ 受体小鼠中。定植 6 周后，与 HFD/STZ 接受者相比，葛根素接受者 (FMT-Pue) 显著改善高血糖、肝脏脂肪变性和损伤（FMT-HFD/STZ，图 6H-N）。葛根素受体中HDAC9和FGF21表达的变化被逆转(图 6O )。总之，这些结果表明，葛根素作为一种益生元制剂，能够以肠道微生物群依赖性方式预防 T2D。

图6 葛根素以肠道微生物群依赖性方式减轻 HFD/STZ 小鼠的高血糖和肝脏代谢紊乱

7 B.Intestinihominis、乙酸盐和葛根素减轻 db/db 小鼠的高血糖和肝脏代谢紊乱

正如预期的那样，给予 LBI、醋酸盐或葛根素可改善 db/db 小鼠的体重、空腹血糖、OGTT、ITT、胰岛素水平和 HOMA-IR 指数（图 7A-H）。LBI、乙酸盐和葛根素治疗显著降低HDAC9并增加FGF21表达（图 7I）。肠上皮屏障功能也得到改善（图 7J-L）。

图7 LBI、醋酸盐和葛根素可减轻 db/db 小鼠的高血糖和肝脏代谢紊乱

结论

总之，来自 2 个独立中心的 T2D 患者粪便中肠人芽孢杆菌的丰度显著降低。口服活B. intestinihominis可减轻 T2D 患者的高血糖和肝脏代谢紊乱。B. intestinihominis来源的乙酸盐抑制 HDAC9 以增加 FGF21 的表达。筛选出的葛根素以肠道微生物群依赖性方式通过促进肠道芽孢杆菌的生长来预防 T2D 。我们的研究强调肠道共生B. intestinihominis作为益生菌，葛根素作为益生元制剂，可缓解 T2D。

Zhang Y, Xu D, Cai X, Xing X, Shao X, Yin A, Zhao Y, Wang M, Fan YN, Liu B, Yang H, Zhou W, Li P. Gut Commensal Barnesiella Intestinihominis Ameliorates Hyperglycemia and Liver Metabolic Disorders. Adv Sci (Weinh). 2024 Dec 31:e2411181. doi: 10.1002/advs.202411181.

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